NK细胞抑制性受体与肿瘤免疫治疗综述

聂 优，李亚卓，程 霞，王宏伟

解放军总医院第四医学中心 病理科，北京 100037

自然杀伤(natural killer，NK)细胞具有直接靶向快速杀伤靶细胞的功能，使其成为抗肿瘤的重要免疫细胞。NK细胞的活化依赖于激活和抑制性受体信号的平衡结果，凭借“自我缺失”式识别模式，辨认异常表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子的恶性细胞，并保持对正常细胞的耐受性。此外，NK细胞也可通过表面受体直接识别靶细胞表面配体，从而调节自身杀伤活性。肿瘤细胞具有逃避NK细胞介导的肿瘤监视能力，这与NK细胞抑制性受体的功能状态密切相关。NK细胞抑制受体也被称为检查点受体，是肿瘤免疫疗法中最具前景的治疗靶标。目前使用针对杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptors，KIR)、NKG2A、程序性死亡受体1(programmed cell death protein1，PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)和T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT)免疫检查点抑制剂的临床前和临床试验已经展开，揭示了联合或单独应用NK细胞在肿瘤治疗中的潜在作用(图1)。本文主要综述人NK细胞表面抑制性受体的类型、功能特点及其在肿瘤免疫逃逸及免疫治疗中的进展。

1 MHC-Ⅰ类特异性抑制性受体

图 1 人类NK细胞抑制性受体及其配体 本文总结人NK细胞抑制性受体与配体，框中显示当前开发应用于临床试验的免疫检查点抑制剂Fig.1 Human cell NK inhibitory receptors and their ligands NK cell-based immune checkpoint-blocking antibody which has been developed for clinical use are displayed in the upper pannel

1.1 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 KIR在所有NK细胞和少数T细胞上表达，分为活化型和抑制型。抑制型KIR包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3，识别HLA-A、HLA-B或HLA-C。成熟的NK细胞必须表达至少一种对自身MHC-Ⅰ类分子特异的抑制性受体(KIR和NKG2A)，以识别和杀死靶细胞并阻止NK细胞对自体细胞的活化。个体之间具有显著不同的KIR-HLA组合，不同KIR单倍型可能对NK细胞功能具有不同的影响，进而影响宿主对感染或肿瘤细胞的免疫应答。一项研究KIR基因型对结直肠癌患者手术预后影响的实验显示，缺乏抑制型KIR但存在激活型KIR与长期无病生存率相关[1]。在探究KIR基因对伊朗地区人头颈部鳞状细胞癌遗传易感性影响的实验，以及讨论KIR基因单倍型影响骨髓增生异常综合征患者临床结局的实验中，也得出类似的结论[2-3]。由此可见，抑制性KIR在不同类型肿瘤中起到了负性调控作用，因此成为免疫检查点阻断治疗的有利靶点。

目前开展了多个临床试验以验证阻断抑制性KIR来增强NK细胞抗肿瘤功能的实际意义。lirilumab(IPH2102)是目前开发靶向KIR2DL1-3的IgG4单克隆抗体，至今已有多个使用lirilumab的临床试验注册完成。Lirilumab单药应用于首次缓解的老年晚期急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者的维持治疗(NCT01687387)，或与其他药物如ipilimumab(抗-CTLA-4)在晚期实体瘤患者中的联合使用(NCT01750580)，均未显示出较单独应用抗CTLA-4更好的疗效。但KIR阻滞剂联合5-氮胞苷作为治疗难治性或复发性AML的初步数据显示，前25名患者中有20%对治疗有反应，其中两名患者获得了完全缓解(NCT02399917)。此外，KIR和PD-1的联合阻断显示接受化疗的晚期头颈部肿瘤患者客观应答率有增加的趋势(NCT01714739)。这些初步数据显示了联合进行KIR阻断的临床应用前景，不过大剂量、长期使用可能会阻碍NK细胞的活化[4]。有研究者认为这与单核细胞和嗜中性粒细胞的胞啃作用有关[5]。

1.2 CD94-NKG2A异二聚体 CD94/NKG2A是与C型凝集素相关的异二聚体抑制性受体，识别人类非经典MHC-Ⅰ类分子HLA-E，在调节NK细胞终末成熟方面具有重要作用。某些类型的癌症，如肾癌、急性髓性白血病和肝细胞癌，HLA-E和HLA-G分子的表达发生异常上调，可能是因为这些自身分子在肿瘤细胞上的表达损害NK细胞的同种异体反应性，从而使癌细胞对NK细胞的杀伤具有抗性。如肾癌细胞在表面表达HLA-E，并且能够促进NK细胞上调CD94-NKG2A异二聚体来抑制肿瘤浸润NK细胞的效应功能[6]。慢性乙肝患者外周血NK细胞频率下降，NKp46和NKG2A表达上调，这些改变与免疫清除病毒有关[7]。此外，NKG2A在肺癌、浸润性乳腺癌患者NK细胞中的上调是肿瘤转移的一个预测因素[8-9]。

人源化抗NKG2A单克隆抗体(IPH2201，monalizumab)已应用于多项临床试验。在血液系统疾病中，阻断NKG2A可改善造血干细胞移植后早期NK细胞的同种异体反应性，从而预防急性和慢性移植物抗宿主病以及机会性感染[10]。同时NKG2A的抑制可显著激活NK细胞以杀死原发性白血病细胞[11]。异基因造血干细胞移植后应用Monalizumab进行治疗的Ⅰ期临床试验(NCT02921685)正在进行，将确定MonalizumabⅡ期试验的最大耐受剂量和推荐剂量。Ⅰ/Ⅱ期临床试验(Nct02557516)使用Monalizumab联合Irutinib(一种已用于治疗慢性淋巴细胞白血病的Bruton's酪氨酸激酶抑制剂)以确定慢性淋巴细胞白血病患者的长期临床效益。Monalizumab也应用到不同的实体瘤临床试验中，Monalizumab联合西妥昔单抗治疗头颈部鳞癌的Ⅱ期临床试验(NCT02643550)显示约31%的患者部分缓解，54%的患者病情无明显进展，而之前的数据显示单药西妥昔单抗治疗的客观缓解率为13%，表明NKG2A阻滞剂与肿瘤靶向抗体联用治疗的有效性。

2 非MHC-Ⅰ类特异性抑制性受体

2.1 TIGIT与CD96 在MHC-Ⅰ类分子表达下调的癌症中非MHC-Ⅰ类特异性抑制性受体可能发挥更突出的作用，在这种情况下，肿瘤细胞可利用这些受体来逃避抗肿瘤免疫应答。CD96以及TIGIT与活化型DNAX辅助分子1(DNAX accessory molecule 1，DNAM-1)竞争性结合脊髓灰质炎病毒受体(poliovirus receptor，PVR)和脊髓灰质炎病毒受体相关2(poliovirus receptor-related 2，PVRL2)后，通过持续的下游通路执行免疫负性调节。TIGIT可抑制人类和小鼠NK细胞的杀伤功能，而CD96主要抑制NK细胞产生干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)[12]。TIGIT在包括子宫内膜异位症、乳腺癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌和结直肠癌的肿瘤浸润淋巴细胞中显著上调[13]。另外感染人类免疫缺陷病毒的患者NK细胞TIGIT水平更高，且此时NK细胞产生干扰素-γ能力较低[14]。有研究者提出TIGIT表达可与NK细胞功能异质性联系起来，可解释为什么不同个体对感染、自身免疫性疾病和肿瘤的易感性不同[15]。

相关动物实验证明，阻断检查点分子TIGIT可防止NK细胞耗竭并引发强效的抗肿瘤免疫[16]。当前有不同团队研制的4种抗TIGIT单克隆抗体应用到临床试验中(图1)。Tiragolumab与抗PD-1联合使用应用于非小细胞肺癌的临床前研

究中(NCT03563716)。由Bristol-Myers Squibb公司开展的一项处于Ⅰ/Ⅱ期的临床研究，将BMS-986207单独或与nivolumab联合使用于晚期实体瘤中(NCT02913313)。由OncoMed Pharmaceuticals开发的etigilimab(OMP-313M32)在一项Ⅰ期临床试验(NCT031119428)中单一或与抗PD-1组合对实体瘤进行治疗。最后由Arcus Bioscience开发的AB154已开始进行Ⅰ期临床试验(NCT03628677)，评估AB154在晚期实体肿瘤中作为单一疗法或与AB122(抗PD-1)联合使用的安全性、药代动力学、药效学和初步疗效。CD96在肿瘤转移模型中的阻断证实了其作为NK细胞检查点受体的作用，但其作用依赖于NK细胞[16]。CD96的抗体阻断促进了小鼠NK细胞IFN-γ的产生，并且与抗CTLA-4、抗PD-1、多柔比星组合较单独使用抗CD96能更有效地控制动物模型中的肿瘤转移[17]。

2.2 程序性死亡受体1与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 PD-1与CTLA-4阻断可以通过其他免疫细胞如肿瘤特异性T细胞直接和间接地增强NK细胞的抗肿瘤活性。有证据表明PD-1在大约四分之一健康人外周血中NK细胞亚群上有高表达，且仅限于NKG2A-KIR+CD57+表型特征的CD56dimNK细胞[18]。功能分析表明，与PD-1-NK细胞相比，PD-1+NK细胞受细胞因子诱导后增殖能力差、脱颗粒率低、细胞因子生成少，但是这些可被抗PD-1抗体逆转[18]，这显示了利用PD-1/PD-L1抑制通路的阻断同时激活NK细胞进行治疗的可行性。 PD-1/PD-L1阻断使体内以细胞毒性表型为特征的NK细胞维持时间增强，使用抗PD-1/PD-L1破坏该抑制途径增强可NK细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤，改善NK细胞释放IFN-γ，并在PDL1+靶细胞存在时部分恢复PD-1+NK细胞的脱颗粒[18-19]。PD-1阻断可诱导T淋巴细胞产生增强NK细胞功能的物质，如IFN-γ，这可能是PD-1抗体临床功效的另一种机制。然而PD-1/PD-L1阻断可能产生免疫不良反应[20]。CTLA-4是T细胞扩增的关键调节因子，在NK细胞上部分表达，结合配体CD80和CD86显示出抑制特性。黑色素瘤患者抗CTLA-4治疗的临床结果与治疗前后TIM-3在循环T细胞和NK细胞中的低表达相关，并且与治疗期间成熟循环CD56dimNK细胞的频率增加相关[21]。抗CTLA-4疗法可能通过阻断抑制性CTLA-4+Treg或恢复CTLA-4+T细胞功能间接改善NK细胞功能[22]。目前，6种针对这两种免疫检查点途径的抗体已被批准用于临床(图1)。

2.3 T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的分子3与淋巴细胞活化基因-3 除了在T细胞上表达，TIM-3几乎在所有NK细胞上都可检测到，尤其是成熟CD56dimCD16+NK细胞。TIM-3的同源配体包括galectin-9(Gal-9)、凋亡细胞中的磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、高迁移率族盒(HMGB1)和癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM1)。目前开发的两种针对TIM-3的抑制剂(图1)单独或与其他药物联合应用于多项临床试验，不过TIM-3对NK细胞的功能作用存在争议。TIM-3在多种癌症患者的外周血NK细胞中上调，且TIM-3表达持续增加与NK细胞衰竭和功能障碍有关，阻断来自晚期黑色素瘤和肺腺癌患者NK细胞的TIM-3可以增加NK细胞毒性和IFN-γ的产生[23]。然而，另有报道称TIM-3阻断会降低NK细胞介导的对胰腺癌细胞的杀伤功能[24]，并且在阻断原发性急性髓性白血病母细胞Gal-9后，NK细胞与其共孵育减少IFN-γ的产生[25]。TIM-3与多个配体的混杂结合可能是其对NK细胞功能有不同影响的原因。

LAG-3在结构上与CD4相似，但与MHC-Ⅱ类分子结合的亲和力高于CD4，在活化的T细胞和NK细胞中表达，LAG-3的另一种潜在的配体是肝和淋巴结窦状内皮细胞C型凝集素。四种针对于LAG-3的检查点抑制剂参与多项临床试验(图1)，显示了其增强T细胞应答的效应性。研究发现利用抗LAG-3或可溶性LAG-3阻断该抑制途径对人NK细胞的细胞毒性没有影响[26]。总之由于TIM-3和LAG-3具有激活T细胞和NK细胞的潜力，它们可能是基于NK细胞免疫治疗的良好候选者，有必要进一步确定TIM-3及LAG-3在NK细胞癌症监测中的确切作用。

2.4 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins，Siglec)家族成员众多，在NK细胞表达的Siglec包括Siglec-7以及Siglec-9。Siglec-7在所有NK细胞上高表达，Siglec-9在CD56dimNK细胞上选择性表达。代表Siglec抑制性配体的唾液酸聚糖(sialylated glycans)的过表达可能是肿瘤细胞逃避NK细胞识别的机制之一。Siglec-7和Siglec-9配体均已在多种肿瘤细胞系中检测到，包括肾细胞癌、黑色素瘤、结肠腺癌、宫颈癌和慢性髓样白血病细胞[27]。Jandus等[28]使用神经氨酸酶对K562细胞和HeLa细胞进行去唾液酸化，可显著增加外周血NK细胞介导的细胞毒性，对Siglec-7和Siglec-9阻断也可增强NK细胞介导的针对K562和HeLa细胞系的细胞毒性。因此，通过改变肿瘤细胞中的唾液酸水平或使用阻滞剂靶向Siglec7和Siglec9，可增强基于NK细胞的肿瘤免疫治疗效果。小分子高亲和力的抑制剂可作为Siglec-7结合配体抑制该受体的作用，如甲基磺酰胺以及使用二唾液酸在多糖葡聚糖(DiSia-Dex)上合成的小分子Siglec-7抑制剂[29-30]。由于两种抑制受体具有极大的相似性，未来的靶向策略调整为同时靶向Siglec-7和Siglec-9，可能以更强的方式增强NK细胞的抗肿瘤效果。

2.5 杀伤细胞凝集素样受体G1 杀伤细胞凝集素样受体G1(killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1)是属于凝集素样超家族的跨膜受体，其通过细胞质ITIM基序介导抑制作用。KLRG1优先在NK细胞和T细胞上表达。三种Ⅰ型钙黏蛋白E-、N-和R-钙黏蛋白(cadherin)为KLRG1的配体，可介导“缺失自我”式识别，引发NK细胞激活。一些肿瘤可利用KLRG1-钙黏蛋白相互作用以逃避免疫监视，如在侵袭性乳腺癌中，一些肿瘤细胞最初下调E-钙黏蛋白以获得运动和转移潜能，随后重新表达以促进黏附并逃避免疫攻击[31]。此外，上皮肿瘤可以从表达E-钙黏蛋白转变为表达N-钙黏蛋白，该蛋白通过与内皮细胞和基质细胞上的配体相互作用，赋予肿瘤更多侵袭性[31]。相关研究显示，在动物模型中抑制KLRG1途径可增强对癌症的免疫控制[32]。在一些病毒感染如人类巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒和人类免疫缺陷病毒的慢性感染期间，KLRG1会在NK细胞、CD8+T和CD4+T细胞中快速上调[33]。然而Grundemann等[34]研究发现，KLRG1-钙黏蛋白相互作用主要抑制CD8+T细胞的扩增及其效应功能，但对NK细胞的细胞毒性几乎没有影响。在今后的研究中需要确定KLRG1-钙黏蛋白结合的分子基础，并继续探究KLRG1途径在人类不同癌症中的调节作用，有助于我们理解其在免疫维持和肿瘤进展中的确切作用并为肿瘤治疗提供新靶点。

3 其他抑制性受体

NK细胞还存在一些分布较为广泛的抑制性受体，如CD300a、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)、白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(leukocyte-associated Ig-like receptor，LAIR-1)及白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin-like receptor，LILR)。磷脂酰丝氨酸(PS)/磷脂酰乙醇胺(PE)和CD300a相互作用，可能在某些肿瘤中介导了一种新的免疫逃逸机制，损害NK细胞及其他淋巴细胞的功能。NK细胞上CEACAM1通过嗜同性和与CEACAM5的嗜异性作用进行细胞间黏附，并可同TIM-3协同抑制NK细胞介导的杀伤作用，干扰NK细胞IFN-γ释放活性[35]。有研究将CEACAM1表达与黑色素瘤进展和转移联系起来，并开始了使用CEACAM1特异性抗体的临床试验[36]。LAIR-1几乎在免疫系统的所有细胞上表达，LAIR-1的配体是胶原蛋白，说明细胞外基质可能具有免疫调节的功能。由NK细胞、T细胞或吞噬细胞介导的针对肿瘤细胞的免疫，可能通过肿瘤增加的胶原蛋白与这些效应细胞上LAIR-1连接而被抑制。相关研究显示LAIR-1在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌可介导免疫逃逸[37-38]。LILR在多种细胞如淋巴和骨髓细胞上都有表达，其具有调节炎症、免疫耐受、细胞分化和神经系统可塑性等多种功能。LILRB1、LILRB2、LILRB5、LILRA2在NK细胞上表达，不过LILR在调节NK细胞活化中的作用尚不完全清楚。除免疫细胞外，LILRB和其相关的含ITIM的受体也由肿瘤细胞表达并促进肿瘤的进展[39]。因此，与CEACAM1类似，LILRBs的阻断可能是一种潜在的癌症治疗方法，不仅可以逆转肿瘤相关免疫细胞的抑制表型，而且还可以直接靶向恶性细胞。

4 结语

NK细胞在抗肿瘤免疫反应中至关重要，对KIR、TIGIT、NKG2A及CD96受体阻断的临床前和临床试验证实，NK细胞功能衰竭可被逆转，同时改善基于T细胞的免疫疗法进而显著增强抗肿瘤治疗效果。但不同肿瘤类型、不同病变阶段之间这些抑制性受体变化是否一致，抑制性拮抗剂的使用对NK细胞毒性和自身免疫性是否有影响，这些检查点抑制剂应用到人类是否有效调节NK细胞功能并改善临床反应、阻断治疗的最佳时机等问题，仍需进一步探讨。目前仍有较多抑制性受体功能尚不完全清楚，多数受体并非NK细胞特异性表达且模式多变。进一步揭示这些抑制性受体在NK细胞与特定肿瘤微环境之间的作用机制，将为开发新的抗肿瘤策略铺平道路。在未来的研究中，针对癌症不同疗法的优化组合，包括应用NK细胞多靶点阻断或与其他检查点阻滞剂联合治疗，将开启癌症免疫疗法的新途径。