纳米氧化锌的生物法合成及固定脂肪酶的研究

尹春华，彭思雨，马垒珍，张海洋，闫海

（北京科技大学化学与生物工程学院，北京100083）

引 言

酶固定化技术是采用载体材料将酶固定或限制在一定的空间内，保留其催化活性，并可回收及重复使用的一类技术，是酶工业应用的关键技术之一。近年来，纳米材料作为新型酶固定化载体，由于具有良好的生物相容性、超大的比表面积和较小的扩散限制等特性而受到人们的广泛关注[1-3]。纳米材料用于固定化具有很多优势，譬如具有巨大比表面积、酶负载量高；能够和酶蛋白分子多点结合，一定程度减少蛋白质去折叠，从而稳定酶的活性构象，固定化后酶的热稳定性、pH 稳定性和操作稳定性都有显著提高[4-7]。

纳米材料的传统制备方法主要包括物理和化学法，具有能耗高、易造成环境污染等不足。近年来，人们愈来愈重视一种合成纳米材料的新型方法——生物法。生物法是指利用微生物或一些高等植物在常温、常压下合成无机纳米粒子，过程中不需使用有毒化学物质，也不产生有毒副产品，具有生态友好和成本低等优点[8]。早在1989 年，Nature 杂志就报道了光滑念珠菌(Candida glabrata)合成纳米CdSe[9]。但生物法引起人们的广泛关注还是在近十几年，2001年Mukherjee等[10]报道尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporum)成功合成Ag 纳米粒子，并首次提出了纳米生物合成技术的概念，此后，纳米材料生物合成的研究报道大量出现[11-13]，纳米ZnO[14]，Au[15]，Ag[16]，Fe3O4[17]和CdS[18]等都已被生物法陆续成功合成。目前纳米材料的生物法合成研究主要集中于植物或微生物种类筛选、合成条件优化及得到的纳米材料的表征分析等，而对得到的纳米材料应用研究较少，尤其在酶固定化的应用鲜有报道。

纳米氧化锌是一种重要的无机纳米材料，与普通纳米材料相比，不仅具有比表面积大、吸附力强等特性，而且具有光化学活性、能高效吸收衰减雷达波、屏蔽紫外线和抑菌消毒等优良性能[16]，在光化学领域[19]、食品和动物饲料[20]以及酶固定化等生物技术[21-22]领域都有广泛应用。Husain 等[22]采用纳米氧化锌成功固定了米曲霉β-半乳糖苷酶，显著提高了酶的pH 和热稳定性。相对于纳米金、银和氧化钛等其他纳米材料，纳米氧化锌用于酶固定化具有成本低、保存方便（纳米氧化锌抑菌性能好）等优势，得到的固定化酶不仅可用于催化物质转化，也可作为生物传感器的酶电极[21]。本研究筛选得到一种高耐硫酸锌的植物乳杆菌用于纳米氧化锌的合成，对得到的纳米粒子进行了一系列的分析表征，并将其用于固定假丝酵母脂肪酶。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

假丝酵母脂肪酶(Candidasp.lipase)，北京化工大学赠送。传统法纳米氧化锌(30 nm± 10 nm,99.9%)购于山东西亚化学工业有限公司。硫酸锌（分析纯）购于天津福晨化学试剂公司，普通氧化锌等其他试剂皆为分析纯，购于国药集团北京化学试剂有限公司。植物乳杆菌菌株LP1～LP4，本实验室保藏。

1.2 植物乳杆菌耐ZnSO4性能测定

往MRS 培养基中加入适量ZnSO4，得到不同ZnSO4浓度(0～80 mmol/L)的MRS 培养基，高压灭菌后分别转接4 株植物乳杆菌，接种量为1%，37℃下厌氧培养48 h。培养中每隔2 h取样，用分光光度计测定菌液的OD600，得到各菌的生长曲线，以各菌在不同ZnSO4浓度培养基中生长最高细胞浓度（用OD600值表示）评价其耐ZnSO4能力，每个ZnSO4浓度均设置3 个平行实验，结果用平均值和标准偏差表示。

1.3 植物乳杆菌合成ZnO-NPs

纳米氧化锌的合成在100 ml 的锥形瓶进行，将高耐ZnSO4的植物乳杆菌LP4 接种（接种量1%）于20 ml 灭菌MRS 中，100 r/min 摇床37℃厌氧培养24 h（OD600为7.0 左右）。接着向该培养菌液加入等体积的0.9%的无菌生理盐水稀释后再厌氧培养24 h。然后无菌条件下用0.4 mol/L 的NaOH 溶液调节pH为6，并加入ZnSO4溶液至其浓度为40 mmol/L，摇匀后置于恒温水浴锅中80℃反应10 min 后，37℃下静置陈化12 h，过滤得到白色沉淀经冷冻干燥即得到粗纳米氧化锌，用于后续表征测试。

1.4 酶活测定方法

酶活测定采用橄榄油乳化法[23]。脂肪酶酶活的定义：脂肪酶在37℃、pH 8.0 下每分钟产生1 μmol脂肪酸所需的酶量，即为1个国际单位（U）。

1.5 扫描电镜测试

将充分干燥后的样品置于研钵内充分研磨，用棉签蘸取少量研磨后的粉末，轻弹棉签使粉末均匀分散在固体导电胶表面，用吸耳球轻轻吹去未被黏附的粉末，喷金后由日立SU8010冷场发射扫描电镜进行测试。

1.6 透射电镜测试

取2 mg 样品于50 ml 的无水乙醇中充分超声分散，用毛细吸管吸取样品滴加在置于圆形滤纸上的铜网上，反复滴加数次，将载有铜网的滤纸片置于日光灯下晾干。将晾干后的铜网置于载样器进行检测，检测仪器为JEM-2010高分辨率透射电镜。

1.7 X射线衍射测试

将干燥后的样品在600℃高温下进行煅烧灰化，并保温3 h，除去纳米材料中的少量菌体，然后将灰化后的样品充分研磨，除去结块，进行XRD 测试确定其晶型。测试角为2θ，测试范围10°～80°。

1.8 紫外可见吸收光谱测试

将干燥后的样品于去离子水中超声分散，静置一段时间后，取上清液于PerkinElmer 酶标仪中进行全波长扫描检测ZnO 纳米粒子的吸收峰，以去离子水作为参照，扫描波长范围200～1000 nm。

1.9 脂肪酶固定化方法

为了排除合成粗产物中菌体对固定化的影响，对其进行简单纯化：将粗产物于水中超声重悬，过0.45 μm 滤膜去除菌体，滤液浓缩干燥后得到白色粉末即生物纳米ZnO 用于酶固定化。往25 ml 锥形瓶中加入pH 8.0 的磷酸缓冲液10 ml，50 mg 的固定化载体（生物纳米ZnO、普通氧化锌、传统纳米ZnO），超声30 min 待载体充分分散后加入适量酶液，200 r/min 摇床中恒温（10℃）吸附固定16 h。然后4℃、10000 r/min 离心10 min 收集固体沉淀，用pH 8 磷酸缓冲液重悬洗涤后再离心收集沉淀经冷冻干燥即得固定化酶，分别测定固定化酶和废液（离心弃液和洗涤液）的酶活，所有实验重复3次，实验结果取其平均值。本文中酶活收率定义为固定化酶总酶活与固定化前加入的游离酶总酶活的百分比。酶固载率为固定载体吸附的游离酶酶活与固定化中加入的游离酶总酶活的百分比，前者由游离酶总酶活减去废液中酶活计算得到。

1.10 游离酶与固定化酶pH 和热稳定性的测定与比较

取冷冻干燥后的50 μg 固定化酶加入到不同pH 的5 ml 磷酸缓冲液中充分分散，置于4℃下放置2 h 后离心去上清液，用pH 8 的磷酸缓冲液重悬，测定残存酶活百分数用于评价固定化酶pH 稳定性（初始酶活定义为100%，测定条件见1.4 节）。热稳定性测定方法：称取质量均为50 μg 的固定化酶置于5 ml pH 8的磷酸缓冲液中，分别于不同温度下恒温放置2 h 后立即降温到4℃，然后测定各自的残存酶活百分数（初始酶活定义为100%）。然后与按同样方法测得的游离酶的稳定性进行比较。

1.11 固定化酶的操作稳定性测定

往25 ml 敞口锥型瓶中加入7.5 mmol 的癸酸与含水4%的甘油(5 mmol)摇匀，接着加入0.2 g纳米固定化酶混匀，40℃恒温摇床中(转速为200 r/min)反应24 h 后取样测定癸酸转化率。每一批次反应结束后，往锥型瓶中加入15 ml体积比为1∶1叔戊醇和正己烷混合溶剂稀释，然后离心回收固定化酶，室温下风干后接着用于下批次反应，每批次实验重复3次，转化率取其平均值。癸酸转化率的测定采用滴定法：吸取0.1 g 左右反应液，加入10 ml体积比为2∶1 的乙醇-乙醚混合液稀释并终止反应，以酚酞为指示剂，用0. 05 mol/L 的NaOH 标准溶液滴定其中的癸酸。

2 结果与讨论

2.1 耐Zn2+植物乳杆菌筛选

利用微生物合成无机纳米粒子，一般需将纳米前体（较高浓度的无机金属离子）加入培养基中，通过微生物的生命活动或其代谢产物将其转换为相应的金属或金属氧化物纳米粒子。因此，微生物耐受相应离子或盐的能力是合成金属纳米粒子的关键因素之一。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，是常见的益生菌，大多生长迅速但耐盐能力不强。为了得到合成纳米氧化锌能力强的植物乳杆菌菌株，本研究先对实验室保藏的4 株植物乳杆菌耐Zn2+能力进行考察：在不同ZnSO4浓度的培养基中接入植物乳杆菌种于37℃厌氧培养，定时取样测定菌液的OD600用以监测其生长情况。结果表明这四株植物乳杆菌生长周期在24～36 h，在含不同浓度ZnSO4的培养基中生长情况见表1，可见这四株植物乳杆菌耐Zn2+能力差异非常显著。菌株LP2 与LP3 耐Zn2+能力较差，只能在ZnSO4浓度低于20 mmol/L 的培养基中生长。LP1 的ZnSO4耐受浓度为40 mmol/L，而LP4 耐受能力最强，在60 mmol/L 的ZnSO4浓度仍然能够生长良好，所以选定LP4作为合成纳米ZnO用菌株。

表1 植物乳杆菌在不同ZnSO4浓度MRS培养基中的生长情况（OD600）Table 1 Growth of L.plantarum in MRS medium of different ZnSO4 concentration（maximum OD600）

2.2 生物法合成ZnO-NPs的表征

收集植物乳杆菌合成得到的白色沉淀，对其进行微观结构、形貌和光学性质的表征。图1 为植物乳杆菌LP4 细胞和合成得到的白色沉淀物（即粗纳米ZnO）煅烧前后扫描电镜图。由图可见该植物乳杆菌菌体长度为0.9～2.5 μm，表面洁净无颗粒物[图1(a)]。而合成粗产物为类球形颗粒状，大小在几到几十个纳米，产物中含有少量植物乳杆菌细胞[图1(b)]。为了获得纯纳米粒子，将合成粗产物600℃下煅烧3 h，使植物乳杆菌菌体细胞灰化干净，将灰化后的灰白色粉末充分研磨后，于扫描电镜下再观察其形貌[图1(c)]，煅烧后产物呈类球形，粒径尺寸在100～300 nm，与煅烧前相比，颗粒尺寸有所增大，出现团结现象，这主要是和样品处理过程中冷冻干燥与煅烧退火有关[24]。

为了更精确分析得到的纳米粒子的大小和形貌，对植物乳杆菌合成的ZnO-NPs 进一步进行了高分辨率透射电镜测试（图2）。图2(a)为合成的粗产物透射电镜图，固体颗粒（ZnO-NPs）成团聚集在菌体表面，颗粒尺寸为9～35 nm，菌体尺寸约为1.3 μm，可见菌体干燥过程中出现了一定程度的变形和收缩。将合成的粗产物煅烧去除菌体再进行测试[图2(b)]，产物ZnO 呈类球形结构，结晶度良好，平均晶粒尺寸约为200 nm，有局部团聚现象，颗粒尺寸明显增大，这是样品颗粒在煅烧退火热处理过程中发生再结晶导致。在退火过程中，晶体内部和表面原子通过热运动到达格点位置，抑制了氧空位和锌间隙的形成，导致部分晶粒间的晶界消失而生成大的晶粒[25]。

图1 植物乳杆菌LP4细胞（a）、植物乳杆菌合成的粗ZnO-NPs（b）和煅烧后ZnO-NPs（c）扫描电镜图Fig.1 SEM micrograph of L.plantarum cells(a),crude ZnO-NPs synthesized by L.plantarum(b),and ZnO-NPs after calcination(c)

图2 植物乳杆菌合成ZnO-NPs（a）与煅烧后（b）透射电镜图Fig.2 TEM micrograph of crude ZnO-NPs synthesized by L.plantarum(a)and ZnO-NPs after calcination(b)

图3为植物乳杆菌合成ZnO-NPs X 射线衍射谱图，谱图中11 个衍射峰依次对应晶格常数a=0.325 nm、c=0.521 nm 六 方 晶 系ZnO 的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）、（201）、（004）、（202）相应衍射面，所有的衍射峰均对应于六方纤锌矿结构，表明植物乳杆菌合成的ZnO-NPs粒子是结晶良好的ZnO六方晶体。并且与ZnO粉末衍射标准卡片相匹配。除ZnO 的衍射峰以外没有出现其他衍射峰，说明样品的结晶度很高。纳米ZnO 光学特性之一是在紫外线280～400 nm（近紫外区）有特征吸收，对可见光区域有很高的透过性[26]。对合成得到的纳米氧化锌进行紫外可见光扫描，结果显示在359 nm 处出现了吸收峰，并且没有出现严重的拖尾现象，这也说明合成的ZnO-NPs 粒子粒径较小，均一度较高。

图3 植物乳杆菌合成ZnO-NPs X射线衍射谱图Fig.3 X-ray diffraction pattern of ZnO-NPs synthesized by L.plantarum

扫描、透射电镜和X 射线衍射等分析测试表明植物乳杆菌LP4 成功合成了纳米氧化锌，但其合成机理尚有待于进一步研究。一些研究表明纳米粒子的合成与细菌分泌的一些蛋白质和脂类物质有关[14,27]，植物乳杆菌负的氧化还原电位对阳离子（Zn2+）的吸引也助于纳米粒子合成的引发。推测合成的化学机理见图4，ZnO 对细菌形成一种应激压力，刺激其分泌一些蛋白或脂类物质，这些物质促使细胞表面ZnO 微核的形成和稳定，而溶液中存在的少量[Zn(OH)4]2-促使ZnO 微核进一步自聚集形成六方晶体结构的ZnO纳米粒子[27-28]。

图4 植物乳杆菌合成ZnO-NPs的化学机理Fig.4 Chemical mechanism of synthesis of ZnO-NPs by L.plantarum

2.3 ZnO-NPs固定化假丝酵母脂肪酶及其性质

固定化是酶工业应用的一种关键技术，固定化载体改进和开发是其研究重点之一。相对于普通的多孔无机载体和有机载体，纳米材料用于酶固定化具有生物相容性好、扩散阻力小、载酶量高和制得的固定化酶稳定性好等诸多优势[29]。物理或化学法等传统法合成的纳米粒子、纳米管和纳米纤维用于酶固定化已有许多研究[7,30]，但生物法合成纳米粒子在固定化酶这方面的研究还未有报道。本实验采用直接吸附法以植物乳杆菌LP4合成的ZnO-NPs作载体对功能多样、应用广泛的Candidasp.脂肪酶[31-32]进行固定化，优化固定化条件并与普通氧化锌和传统法合成的ZnO-NPs 粒子固定化效果进行比较，结果见图5。生物法合成的ZnO-NPs 用于酶固定化表现理想，酶活收率分别比普通氧化锌和传统纳米ZnO 提高了114.2%和20.5%。普通氧化锌的酶活收率较低主要是因为其吸附力相对弱，酶固载率低导致的。生物法纳米氧化锌对酶的固载率与普通纳米氧化锌几乎没有差异，但固定化酶活收率却明显高于后者（图5），主要原因可能与生物ZnO-NPs 表面包覆一些生物大分子有关。正如上文纳米氧化锌合成化学机理以及大量文献报道[8,14,27]所述，生物合成的纳米粒子表面裹有一些蛋白质、多糖和脂类等大分子，而非酶蛋白等大分子可有效改善固定化酶中酶分子作用微环境[33-35]，因此生物纳米氧化锌表现出高的表观活性。

图5 不同ZnO固定Candida sp.脂肪酶的比较Fig.5 Comparison of immobilized Candida sp.lipase on various types of ZnO

图6 生物法ZnO-NPs固定化酶与游离酶的pH和热稳定性比较Fig.6 Stabilities of free lipase and immobilized lipase prepared by biosynthesized ZnO-NPs

图6 是生物纳米ZnO 固定脂肪酶和其游离酶的pH 和热稳定性比较，固定化酶的pH 稳定性明显高于游离酶[图6(a)]，尤其在酸性条件下优势更为明显：在pH=5 条件下放置2 h 的固定化酶活性相对于初始酶活降低了47.4%，而游离酶活降低了76%。可能原因是纳米粒子的多点吸附影响并稳定了酶分子的空间结构，增强了其抗酸碱的能力[36]。图6(b)是固定化酶的热稳定性：在20～45℃任一温度下放置2 h 后固定化酶的剩余活力都高于游离酶活力，可见该酶被生物ZnO-NPs 固定后热稳定提高明显。

除了pH 和热稳定性，重复使用性能——操作稳定性的高低也是评价固定化酶优劣的关键指标。本研究以癸酸甘油酯的合成为模式反应对生物纳米固定化酶的操作稳定行进行了测定。癸酸甘油酯是一种重要的中链甘油酯，常用作婴儿及肠胃吸收功能障碍患者的营养品。图7为固定化酶操作稳定性实验结果（实验条件已经优化），重复使用5 批次后该酶催化活性没有明显下降，癸酸的转化率仍能维持90%左右，直到第7 批次催化活性才损失一半左右，与先前采用交联酶聚集体法固定的脂肪酶重复使用性能相当[2]，可见该生物纳米吸附法固定化酶具有较好的稳定性和催化活性。

3 结 论

图7 生物ZnO-NPs固定化酶重复使用性能Fig.7 Reusability of immobilized lipase on biosynthesized ZnO-NPs

采用筛选得到的一种高耐Zn2+的植物乳杆菌成功合成了纳米ZnO。扫描电镜、透射电镜和X 衍射等手段分析表明，生物合成的纳米材料为9～35 nm的ZnO-NPs 粒子，其最大紫外可见吸收峰在359 nm，晶格呈现纤锌矿结构。将得到的纳米粒子应用于直接吸附法制备固定脂肪酶，固定化酶活收率分别比普通氧化锌和纳米氧化锌高114.2%和20.5%。生物纳米氧化锌固定化酶的pH 和温度稳定性都得到明显提高，而且具有较好的重复使用性能。微生物合成纳米氧化锌不仅合成过程绿色、无毒、环境友好，而且产物用于酶的固定化有独特优势。