蓝狐源沙门氏菌的分离鉴定与敏感药物筛选

王玉芝 王光锋

（①山东省潍坊市畜牧兽医局 261061 ②山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊）

沙门氏菌病，又名副伤寒(paratyphoid)，是各种动物由沙门氏菌属细菌引起的疾病总称。临诊上多表现为发热、败血症和肠炎，也可使怀孕母畜发生流产[1]。沙门氏菌包含2500多种血清型，绝大多数能引起人和动物的多种不同的沙门氏菌病，不同血清型沙门氏菌的致病性也不同[2]。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首[3,4]，所以该菌在公共卫生上具有重要意义。因此早期诊断、及时指导临床用药可以有效减少感染、传播，从而减轻经济损失。2019年6月至8月，山东高密、胶州多家养狐场饲养的蓝狐发病，病狐精神沉郁，体温升高到40～41℃，拉黄绿色水样粪便，怀孕母狐流产率达到10%。幼狐为急性经过，病程2～3d死亡，剖检发现肝脏肿大，呈土黄色，脾脏明显增大，呈暗褐色。本试验从送检病死蓝狐肝脾病料中，分离到2株细菌，通过病原分离鉴定及动物回归试验，鉴定为沙门氏菌，并筛选了敏感药物，为狐沙门氏菌病的临床诊断和有效防治提供了理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料及试验动物 病料采自山东高密、胶州发病养狐场病死狐的肝脏、脾脏组织；60日龄健康蓝狐购自高密某养狐场。

1.1.2 主要试剂 普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基、亚硫酸铋(BS)琼脂；微量生化发酵管、药敏试纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离与培养 将无菌采集的病死幼狐肝、脾病料，分别划线接种于营养琼脂、麦康凯琼脂培养基、BS琼脂上，37℃倒置培养18～ 24h，观察细菌在不同培养基上的生长情况，挑取典型菌落，进行细菌的纯化，并保存备用。

1.2.2 细菌形态学镜检 挑取BS培养基上纯化的单个菌落，涂布于滴有生理盐水的载玻片上，干燥固定后革兰氏染色，镜检观察细菌形态特征。

1.2.3 细菌生化鉴定 将初步鉴定为沙门氏菌的菌株，接种于BS琼脂37℃培养18～24h，取菌落加入到0.9%生理盐水中制成均匀悬液液，测比浊度在0.5～0.65个麦氏单位之间。将制备好的菌悬液接种各种生化反应管，37℃孵育24～48h。根据生化反应管说明书记录结果。

1.2.4 16S rRNA基因检测 取分离菌株的新鲜菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的基因组DNA。采用已发表的16S rRNA通用引物27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1492R: 5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，对分离菌株16S rRNA基因进行扩增，预期扩增DNA片段大小为1504bp。PCR反应用30μl反应体系，2×PCR Mix 3.0 15μl，提取的细菌基因组DNA 2μl，上、下游引物各2μl，灭菌水9μl，离心混匀。反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s、56℃退火45s、72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取6μl扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并将PCR产物送华大基因生物工程公司进行基因测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，以确定分离菌株的种类。

1.2.5 致病性试验 将纯化的细菌接种于营养肉汤，37℃恒温培养16h，用灭菌生理盐水将菌悬液稀释至细菌浓度为1×109cfu/ml备用。将15只60日龄健康幼狐随机分为4组，第1、2组为试验组，每只幼狐腹腔注射浓度分别为109cfu/ml的细菌悬液0.5ml；第3组作为对照组，每只幼狐腹腔注射0.5ml无菌生理盐水。每天观察、记录狐狸的发病死亡情况，死亡狐剖检并进行细菌的分离。

1.2.6 药物敏感性试验 按照CLSI推荐的K-B法对已分离得到的菌株进行药敏试验。将37℃培养至15h的细菌培养物用生理盐水稀释，利用麦氏比浊仪调至0.5麦氏单位，将稀释好的菌液用无菌L棒均匀涂布，选取头孢西叮、米诺环素、环丙沙星等32种药敏纸片贴于培养基上，37℃培养24h后观察结果。结果判定标准参照所用药敏纸片说明书进行。

2 结果

2.1 细菌分离培养镜检结果

从不同养狐场病死蓝狐肝脏、脾脏病料中分离到2株细菌，分别命名为GMS1、JZS2，分离菌株在营养琼脂平板和麦康凯琼脂均上形成中等大小、表面光滑、边缘整齐、无色半透明的菌落。在BS琼脂上形成中等大小、有金属光泽的黑色或棕褐色菌落。镜检可见分离细菌为单个或成对排列、两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。

2.2 细菌生化试验结果

结果表明分离菌株不能分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，甲基红试验阳性，V-P试验阴性，不产生靛基质，不水解尿素，H2S试验阳性，与报道的沙门氏菌的生化特性一致[2,5]。

2.3 致病性试验结果

实验组蓝狐接种细菌后24h出现体温升高、精神沉郁、食欲下降，下痢、个别呕吐，48h开始死亡，96h全部死亡。死亡蓝狐剖检病变主要为肝、脾肿大出血，出现粘膜黄疸。从病变组织分离到细菌，经鉴定为沙门氏菌。对照组蓝狐无明显症状。

2.4 PCR检测结果

以分离的细菌基因组DNA作为模板，利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，电泳结果显示2株细菌均获得大小约1500bp的条带，与预期结果相符(附图)。测序结果在GenBank进行Blast比对，分离菌株与收录的沙门氏菌参考株核苷酸序列同源性达到99%以上，进一步证实分离菌株为沙门氏菌。

附图 分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果显示，在测定的30种常用药物中，分离的2株沙门氏菌(GMS1、JZS2)对头孢吡肟、头孢噻吩、卡那霉素、头孢哌酮、头孢曲松、诺氟沙星、头孢噻肟7种药物敏感，占试验药物的23.3%；对头孢西叮、氨曲南、头孢唑啉等9种药物中介以上，占30.0%；对多粘菌素BG MS1敏感，JZS2耐药；对万古霉素、四环素、麦迪霉素等10种药物耐药，占33.3%(附表)。

3 讨论

（1）沙门氏菌作为一种人畜共患病病原菌，在公共卫生上具有重要意义。本研究从不同养狐场发病的蓝狐肝脏、脾脏中分离到2株细菌，经细菌分离培养、形态镜检、生化试验鉴定为沙门氏菌。致病性试验结果显示2株分离菌对健康幼狐均有较强的致病作用，从人工感染的蓝狐体内分离的细菌，经鉴定与临床分离致病菌株形态特征一致，证实分离菌株是该病的致病菌 株。以16S rRNA序列分析为基础的细菌鉴定技术，已广泛用于多种细菌的检测[6-8]，本文采用通用引物对分离菌株的16S rRNA基因进行了扩增、测序，所得序列经过同源性比对，进一步确定分离菌株为沙门氏菌。（2）在本研究检测的30种常用药物中，分离细菌对头孢吡肟、头孢噻吩、卡那霉素、头孢哌酮、头孢曲松、诺氟沙星、头孢噻肟7种药物敏感，占试验药物的23.3%；对万古霉素、克林霉素、米诺环素、四环素、氨苄西林、青霉素、苯唑西林、左氟沙星、红霉素、麦迪霉素等10种药物耐药，占33.3%，这说明分离菌株对多种抗菌药物产生了抗药性，与其它关于沙门氏菌病耐药性的报道不太一致[9,10]，可能与不同地区使用抗菌药物的种类、浓度等有关。沙门氏菌能产生aac(3')Ⅱc、aac(3')-IV、aad A1、tet(A)、tet(C)、cat2、blaTEM-17等多种耐药基因，因而极易产生耐药性[9]。因此，临床上发生该菌感染时，最好依据药物敏感性试验结果筛选敏感药物进行治疗，以防止耐药菌株的产生。（3）沙门氏菌血清型众多，尚未有效疫苗进行预防。近年来，毛皮动物因感染沙门氏菌而致病时有报道[2,9,11]，沙门氏菌病已严重影响毛皮动物养殖业的发展，作为人畜共患传染病病原，更应引起重视。本研究通过对分离于发病蓝狐的菌株进行鉴定及药敏试验，为蓝狐沙门氏菌的鉴定及其疾病的诊断、治疗提供了参考依据。

附表 分离菌株药敏试验结果