姬松茸多糖对2型糖尿病大鼠SREBP-1c和SCD-1蛋白表达的影响

陈翠翠,白丽娟,梁焕坤,钟树海,彭凤兰，李佳丽,李来庆*

(1.广州优迪生物科技股份有限公司,广东 广州 510000；2.广东省微生物研究所/省部共建华南应用微生物国家重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室/广东省微生物应用新技术公共实验室,广东 广州 510663; 3.广东粤微食用菌技术有限公司,广东 广州 510070；4.山东省泰安荣军医院，山东 泰安 271000)

0 引言

2型糖尿病占糖尿病患者的90%～95%，其高发病率和死亡率、难治愈的特点严重威胁人类健康和生活质量[1-2]。该病会导致血液中血糖含量居高不下，造成糖代谢紊乱，引发各种并发症，导致机体各种组织发生损伤和功能障碍，如心血管疾病、周围神经病变、糖尿病足综合征、视网膜病变和肝损伤等。其中，肝损伤较为严重，会形成脂肪肝甚至是肝硬化。SREBP-1c是固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element-Binding Proteins，SREBP)的异构体，在肝脏中高表达。SCD-1，硬脂酰辅酶A去饱和酶1(steroyl-co A desaturase-1，SCD-1)的亚型，是一类催化饱和脂肪酸形成单不饱和脂肪酸的内质网跨膜蛋白，是 SREBP-1c下游的基因，在肝脏和脂肪组织富集表达[3]。有研究[4-6]表明，SREBP-1c和SCD-1可调控三酰甘油、胆固醇等脂质的合成与吸收，异常表达将引起脂代谢的紊乱，引发肝脂肪变，在糖尿病肝脏病变发生发展过程中具有重要作用。姬松茸(AgaricusblazeiMurill)，蘑菇科蘑菇属真菌，其多糖在延缓肿瘤病程、增强集体免疫功能、抗氧化、提高造血功能和保肝护肝方面具有显著疗效[7-9]。姬松茸多糖可减轻糖尿病大鼠肾组织氧自由基损伤，改善血糖及炎症反应，增强免疫功能，促进脂肪分化，但具体的作用机制仍不明确[10-11]。基于此，笔者在建立2型糖尿病大鼠模型的基础上，观察姬松茸多糖在调节糖尿病大鼠糖脂代谢及肝脏SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白表达的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验大鼠为SPF级健康SD雄性大鼠，体重(190±20)g，8周龄左右，未交配，60只。购自南方医科大学实验动物中心[许可证号:SCXK(粤)2016-0041]。饲养环境：温度(22±1)℃，湿度(55±5)%，光照条件为12 h光/暗周期，SPF级维持鼠料由广东省医学实验动物中心提供[粤饲证(2019)05073]，饮水及垫料经121 ℃高压灭菌。大鼠喂养在消毒后的鼠笼中，并给予自由饮水和进食，经1周的实验环境适应之后开始大鼠糖尿病建模实验。

1.2 实验仪器

链脲佐菌素购自Sigma公司；血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，葡萄糖检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，ECL发光液、BCA蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；全自动生化分析仪(7020)购自日本日立，倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯，姬松茸多糖购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，高脂高糖饲料饲料配方参照文献[12]的基础上做部分调整，修改后为：65%大鼠维持饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、2.5%蛋黄粉。

1.3 抗体

兔抗大鼠SCD-1，购自英国ABCam公司；兔抗大鼠SREBP-1c，购自美国Affinity公司；小鼠β-actin内参抗体、马抗小鼠IgG/HRP、山羊抗兔IgG/HRP购自美国CST公司。

1.4 实验方法

姬松茸多糖配方在参考文献[13]上修改为姬松茸多糖纯度为50%，购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，按实验需要配成相应浓度溶液。

1.4.1 大鼠糖尿病模型的制备和分组

大鼠糖尿病造模方法[12,14-15]：将大鼠(随机数字表)分为2组(分别为A组和2型糖尿病模型组)，A组：空白对照组，10只，SPF级维持鼠料+自由饮水；2型糖尿病模型组：56只，高脂高糖饲料+自由饮水。喂养8周后，禁食不禁水12 h，模型组腹腔注射链脲佐菌素STZ(35 mg/kg)，A组注射同剂量柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液，第二天重复1次。第二次注射24 h后尾静脉取血，检测血糖，连续检测3 d，若大鼠3 d的空腹血糖含量均≥11.1 mmol/L则认为造模成功(最终造模成功的大鼠有35只)。将造模成功的大鼠(随机数字表)分为模型组(B组)、姬松茸多糖高(C组，150 mg/kg)、中(D组，100 mg/kg)、低剂量处理组(E组，50 mg/kg)和二甲双胍组(F组，150 mg/kg)，每组7只。姬松茸多糖处理处理方法参照文献[13]，C-D组的大鼠灌胃4 mL相应浓度姬松茸多糖浓缩液，A和B组灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续灌胃4周。A-F组饲料不变，自由饮水。最后一次灌胃72 h后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，留取三分之一用于血糖检测，剩余血液室温静置20 min后，2 500 rpm离心30 min，收集血清-80 ℃保存备用。取血结束后，处死，取肝脏，部分置于-80 ℃保存备用，剩余部分肝脏组织至于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色实验。

1.4.2 生化指标检测

采用全自动生化分析仪测定A-F组42只大鼠的空腹血糖、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量，具体操作步骤按试剂盒说明进行测定。

1.4.3 肝组织HE(Hematein Eosin)染色

染色方法[3]：取经4%多聚甲醛溶液固定48 h后的肝脏组织，流水冲洗，酒精梯度脱水、二甲苯组织透明、浸蜡3次、石蜡包埋。修块、切片、烤片，二甲苯脱蜡、酒精梯度脱笨、HE染色、乙醇洗脱、二甲苯透明、中性树胶封片，镜下观察组织病理学改变。

1.4.4 qRT-PCR法检测肝组织SREBP-1c和SCD-1 mRNA表达水平

使用TRIZOL试剂(Invitrogen)从大鼠肝组织中提取总RNA。通过Invitrogen设计特异性引物并合成(引物序列见表1)用于qRT-PCR。逆转录反应程序如下：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，34 s，40个循环；每个标本3个复孔，以GAPDH为内参，重复3次。

1.4.5 Western blot法检测肝组织SREBP-1c和SCD-1蛋白表达水平

实验步骤[3]：肝组织液氮研磨，裂解，提取总蛋白，BCA定量蛋白浓度，每孔上量30 μg。SDS-PAGE电泳，80 V，20 min；120 V，60 min。转膜，100 V，60 min。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗孵育过夜，洗膜3次；二抗室温孵育2 h，洗膜3次，加ECL显示，暗室X光胶片曝光。

表1 相关基因引物序列Tab.1 Related gene primer sequences

1.5 数据处理

采用Graphad Prism 5.0统计软件(Graphad Software, Inc.)对所得数据进行统计、分析，用均数±标准差(MEAN±SD) 表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA) ，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 姬松茸多糖对大鼠空腹血糖和血脂水平的影响

由表2可见：与A组相比，B组FBG、TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C显著下降；C组、D组和F组FBG较B组显著降低，HDL-C显著升高，差异有统计学意义；与B组相比，E组FBG有降低趋势，但其差异无统计学意义。

表2 姬松茸多糖对糖尿病大鼠空腹血糖和血脂水平的影响Tab.2 Effects of Agaricus blazei Murill on FPG and blood lipid levels in rats

注:A空白对照组;B 2型糖尿病模型组;C姬松茸多糖高剂量组;D姬松茸多糖中剂量组;E姬松茸多糖低剂量组;F二甲双胍组;*为P<0.05。

2.2 肝组织HE染色结果

由图1可知：A组肝细胞大小均匀、肝小叶结构规则；与A组相比，B组肝小叶结构不清，肝细胞排布紊乱，与周围细胞连接松散，部分发生脂肪变性，出现细胞坏死；与B组相比，C组和F组，肝细胞大小均匀、少量的脂肪变性，肝小叶结构规则；D组肝细胞大小较均匀，少量的细胞坏死，排列紊乱；E组肝小叶结构不清，肝细胞排布紊乱，与周围细胞连接松散脂肪变性较少、少量细胞坏死。

注:A空白对照组;B 2型糖尿病模型组;C姬松茸多糖高剂量组;D姬松茸多糖中剂量组;E姬松茸多糖低剂量组;F二甲双胍组图1 大鼠肝脏HE染色结果(×400)Fig.1 The results of HE staining in rat liver

2.3 姬松茸多糖对肝组织SREBP-1c和SCD-1 mRNA的影响

由图2可知：与A组比较，B组SREBP-1c和 SCD-1 mRNA表达明显升高(P<0.05)；与B组相比较，C组和F组SREBP-1c和SCD-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，D组SREBP-1c和SCD-1 mRNA的表达水平降低(P<0.05)，E组SREBP-1c和SCD-1 mRNA的表达有降低的趋势，但没有统计学差异。

注:A空白对照组;B 2型糖尿病模型组;C姬松茸多糖高剂量组;D姬松茸多糖中剂量组;E姬松茸多糖低剂量组;F二甲双胍组。图2 qRT-PCR检测SREBP-1c和SCD-1 mRNA表达Fig.2 The protein expression analysis of SCD-1 and SREBP-1c by Western blot

2.4 姬松茸多糖对肝组织SREBP-1c和SCD-1蛋白表达的影响

由图3可知：与A组比较，B组SREBP-1c和 SCD-1蛋白表达明显升高(P<0.05)；与B组相比较，C组和F组SREBP-1c和SCD-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，D组SREBP-1c和SCD-1蛋白的表达水平降低(P<0.05)，E组SREBP-1c和SCD-1蛋白的表达有降低的趋势，但没有统计学差异。

注:A空白对照组;B 2型糖尿病模型组;C姬松茸多糖高剂量组;D姬松茸多糖中剂量组;E姬松茸多糖低剂量组;F二甲双胍组。图3 Western blot 检测SREBP-1c和SCD-1蛋白表达Fig.3 The protein expression analysis of SCD-1 and SREBP-1c by Western blot

3 讨论

目前，临床上多采用二甲双胍等西药治疗糖尿病，虽其降糖效果明显，临床应用较为广泛，但其治疗过程中容易引起患者乳酸性酸中毒[16]。为此，越来越多的研究者们开始寻找高效安全的天然降糖药。杨旭东[10]、王丽娟等[13]研究显示，姬松茸多糖对控制糖尿病病情进展、降低血糖和脂肪分化相关蛋白具有明显效果。基于当前姬松茸多糖改善糖尿病预后的相关作用机制尚未研究透彻，笔者拟通过腹腔注射STZ 复制糖尿病大鼠模型，对其中部分大鼠进行不同剂量的干预，并同时与二甲双胍的干预效果进行比较。结果显示：采用姬松茸多糖干预后，低剂量组、中剂量组、高剂量组血清FBG水平均低于糖尿病模型组，且随着姬松茸多糖剂量增加，大鼠血清中血糖改善越明显，高剂量组血糖控制效果与二甲双胍组相当。提示姬松茸多糖能降低大鼠血糖水平，与国内已有的相关报道相吻合[11,17]。

PAQUETTE A等[18]研究表明，SREBP-1c的过度表达是促进脂质合成的基因表达增强的原因，而SCD-1是一种构成脂质稳态中关键控制点的酶，它催化了甘油三酯合成所需的单不饱和脂肪酸生物合成中的限速步骤。本研究HE染色结果表明，2型糖尿病模型组大鼠肝小叶结构不清，肝细胞排布紊乱，部分发生脂肪变性，出现细胞坏死。而经姬松茸多糖高、中剂量组和二甲双胍干预后，肝小叶结构清晰、肝细胞排列规则、肝脏细胞脂肪变性得到明显改善，提示高、中剂量的姬松茸多糖能够改善肝脏细胞脂肪变性，对肝脏具有一定的保护作用。进一步比较各组大鼠血脂水平和肝脏SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白的表达发现，给药后二甲双胍组、姬松茸多糖高、中和低剂量组中肝脏SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白的表达降低，各药物干预组的HDL-C水平高于糖尿病模型组，而TC、TG、LDL-C水平低于2型糖尿病模型组。MAUVOISIN D等[19]研究证实，在2型糖尿病的发生过程中，SREBP-1c高度表达，SREBP-1c转录因子与SCD-1启动子结合后，可以上调SCD-1基因的转录，最终导致脂质合成增加，这导致肝脏中的积累，引起肝损伤。这提示姬松茸多糖的作用机制可能是通过降低肝脏中SREBP-1c的表达，SREBP-1c转录因子与SCD-1启动子结合后，下调SCD-1基因的转录进而抑制机体脂肪酸和甘油三酯的合成，防止肝脏脂肪堆积、损伤肝脏。

综上可见，姬松茸多糖高、中剂量对STZ诱导的2型糖尿病大鼠干预后，血糖水平、肝脏 SREBP-1c和SCD-1 表达降低，肝脏细胞脂肪变性和肝细胞坏死减少，对肝脏有一定的保护作用，在治疗2型糖尿病中具有较高的应用前景。