基于网络药理学研究薄荷活性成分治疗慢性胆囊炎的作用机制

孔 丽1，2 左华江2 吴春凤1

1.广西医科大学附属柳州市人民医院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学，广西 柳州 545006

慢性胆囊炎是一种胆囊慢性炎症病变[1]，属于慢性炎症性疾病，临床表现为反复右上腹疼痛或不适、 腹胀、嗳气、厌油腻[2-3]。女性患病率高于男性[3]，且中老年群体为高发群体[1]。慢性胆囊炎属中医“胆胀”范畴，以右胁胀痛为主，针对该病的治疗，近年来采用中医治疗，取得了较好的疗效。

薄荷作为唇形科薄荷属植物[4]，具有抗病毒、兴奋中枢、抗菌[5]、保肝利胆、抑菌、抗氧化、抗炎[6]等药理作用，在《药性论》等多部古代医药典籍中，薄荷均被记载具有发汗解表作用，可用于温病的治疗。薄荷的主要成分包括挥发油、黄酮类等。挥发油中主要成分为左旋薄荷醇，其含量高达62%～87%[4，7，8]，左旋薄荷酮等。研究表明，薄荷醇和薄荷酮有明显的利胆作用，其中薄荷醇在胆道的主要代谢产物中起了利胆的作用[4-5]。薄荷中的黄酮类成分中最主要的成分为蒙花苷，具有良好的抗菌作用[7]。虽然薄荷中的挥发油成分据报道已有治疗慢性胆囊炎的作用[5]，但其活性成分及其相关作用机制尚不清楚。因此，研究薄荷中活性成分、作用靶点及其可能的作用机制，为进一步揭示薄荷治疗慢性胆囊炎具有重要意义。

传统的药理学研究大多是基于“单因素观察”，即证明药物的某一方面的作用，需要通过对照试验、施加单一因素作用，以揭示药物对于疾病的作用机制[9]，而中药具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点[10]，因而传统药理学的研究方法与中药的研究理念相悖。而网络药理学是系统生物学、网络生物学等多种学科技术发展结合的结果，其以药物、靶点以及疾病之间的网络关系作为基础，通过网络分析手段，从整体性的角度出发，研究中药的特征，观察药物对疾病的影响，将网络药理学应用到中药中能够提升中药研究的现代化水平[11]。程晓平等[12]采用网络药理学方法探讨了独活治疗骨关节的作用机制；李刚等[13]采用网络药理学方法对淫羊藿抗骨质疏松的分子机制进行了分析；王韧等[14]采用网络药理学方法从分子角度分析鱼腥草治疗支气管炎的作用机制。因此本文基于网络药理学的方法对薄荷中的活性成分治疗慢性胆囊炎的作用机制进行探讨，可以提高其治疗效果，临床试验的成功率以及降低其毒副作用。

1 材料和方法

1.1 薄荷中活性成分的筛选 通过中药系统药理学数据库(TCMSP)(http://tcmspw.com/)，检索薄荷的化学成分，并根据口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、化合物含量以及明确的生物活性报道，筛选出薄荷中可能有效的活性成分。

1.2 潜在治疗靶点的预测 通过TCMSP数据库检索上述薄荷相关活性成分的靶点，将其导入Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库，并限定物种为人类，将检索得到的所有靶点校正为该靶点的基因名称，用于后续其它工作的分析。通过GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”为检索关键词，搜索慢性胆囊炎相关靶点，将其与上述所得薄荷活性成分靶点进行匹配，得到交集靶点，即为薄荷活性成分治疗慢性胆囊炎的潜在治疗靶点。

1.3 活性成分-作用靶点网络构建与分析 将薄荷活性成分与潜在治疗靶点导入Cytoscape Version3.7.0软件，构建薄荷活性成分-潜在治疗靶点网络图。

1.4 蛋白互作网络的构建 将潜在治疗点导入String(https://string-db.org/)数据库，限定物种为人，设置最低相互作用阈值为0.4，获取蛋白相互作用关系，结果以TSV格式保存，保留node1、noe2、Combined score信息，将这三个信息导入Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络图，并对网络进行分析，保存分析结果，将节点大小和颜色设置用于反映Degree的大小，边的粗细用于反映Combined score的大小，获取最终的蛋白相互作用网络图。本研究基于以下参数：平均最短路径(Average Shortest Path Length)、介数中心性(Betweenness Centrality)、中心接近度(Closeness Centrality)、聚类系数(Clustering Coefficient)、度值(Degree)，以评估节点在网络中的重要程度。

1.5 生物学过程与通路分析 利用Metascape数据库对潜在治疗靶点进行生物学过程与通路分析，将潜在治疗靶点输入数据库，设置物种为人类进行分析，取P<0.05，得到生物学过程与通路分析结果。

1.6 潜在治疗靶点靶点类型归属 利用DisGeNET(http://www.disgenet.org/)数据库对潜在治疗靶点进行检索，将潜在治疗靶点依次输入数据库，获取靶点类型信息(Protein Class)。

2 结果

2.1 薄荷中活性成分的筛选 通过TCMSP数据库共获得薄荷化学成分164个，根据口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、化合物含量以及明确的生物活性报道，筛选出15个潜在的活性成分。详见表1。

表1 薄荷活性成分信息

2.2 潜在治疗靶点的预测 通过TCMSP数据检索薄荷活性成分相关靶点，将这些靶点导入Uniprot数据库，限定物种为人，进行靶点基因名称的校正，去重后共得到57个靶点(其中Fortunellin、Linarin无相关作用靶点)。通过GeneCards数据库，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”为检索关键词，搜索得到慢性胆囊炎相关靶点，将活性成分作用靶点与疾病相关靶点进行匹配(见图1)，得到40个潜在治疗靶点。

2.3 活性成分-作用靶点网络构建 将薄荷活性成分和潜在治疗靶点导入Cytoscape软件构建活性成分-潜在治疗靶点网络图，详见图2。图中共涉及53个节点(13个化合物，40个潜在作用靶点，由于Fortunellin、Linarin无作用靶点，故在网络中不体现)，69条边。不同的颜色和形状代表薄荷活性成分和靶点，绿色菱形节点代表薄荷活性成分，蓝色三角形代表潜在治疗靶点，边代表活性成分与潜在作用靶点之间的关联。

2.4 蛋白互作网络构建与分析 将上述作用靶点导入String数据库，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，以TSV格式保存其结果。保留node1、noe2、Combined score信息，将这三个信息导入Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络图，见图3，并进行网络拓扑属性分析，见表2。图中节点表示靶点，边表示靶点之间的联系，由图3可见，蛋白互作网络共涉及38个节点，266条边(其中PRSS1，CHRM3与其它靶点无相互作用，故没有在网络中体现)。节点的大小和颜色表示Degree值的大小，节点越大，颜色逐渐变深对应的Degree值越大。边的粗细表示Combine score，边越粗Combine score越大。经计算后可知，平均连接度约为14，平均最短路径长度约为1.71，平均介数约为0.02，平均聚类系数约为0.7。具有高度值(连接度)和介数中心的靶点可被认为是中心靶点，在此网络中，度值和介数中心均超过平均值的有10个，分别是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG，可认为这10个是薄荷治疗慢性胆囊炎的关键作用靶点。

表2 潜在治疗靶点的网络拓扑属性表

2.5 生物学过程与信号通路分析 利用Metascape数据库对潜在治疗靶点进行生物学过程与信号通路通路分析，设定P<0.05，筛选靠前的生物过程，主要包括对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、对酸性化学物质的反应(response to acid chemical)、上皮细胞增殖(epithelial cell proliferation)、对铵离子的响应(response to ammonium ion)、血液循环(blood circulation)、细胞对过氧化氢的反应(cellular response to hydrogen peroxide)等。潜在治疗靶点主要富集在13条信号通路，包括Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、Breast cancer、HIF-1 signaling pathway等信号通路。分析结果见图4。

2.6 潜在治疗靶点 靶点类型归属将40个潜在治疗靶点依次导入DisGeNET数据库，获取其对应的类型，详见表3。结果表明薄荷活性成分治疗慢性胆囊炎过程中有信号分子、转录因子、受体、蛋白、酶等物质的参与。

表3 潜在治疗靶点的类型归属

3 结论与讨论

薄荷具有保肝利胆的作用，是治疗慢性胆囊炎的有效药物，以其挥发油作为主要成分的药物在治疗胆囊相关疾病已有报道[5]。根据网络药理学的相关理念和技术，本研究对薄荷治疗慢性胆囊炎作用机制进行了预测，利用TCMSP数据库，并根据OB≥30%、DL≥0.18、化合物含量以及明确的生物活性报道筛选得到有效活性成分15种，获取活性成分靶点，将其与慢性胆囊炎相关的靶点取交集，共得到40个潜在治疗靶点，将潜在治疗靶点作蛋白互作网络分析，结果显示EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG在网络的中心位置，具有较高的Degree值和介数中心性，可能为薄荷治疗慢性胆囊炎的关键靶点。表皮生长因子(EGFR)是原癌基因的一种表达产物，其表达部位在细胞质与细胞膜上，在慢性胆囊炎的组织中，EGFR的阳性表达率约为20%[15]；c-Myc是MYC原癌基因族中的一员，c-Myc被异常激活后，其表达明显升高，引起细胞增殖，同时抑制有关分化的基因表达，降低细胞的终末分化[16]；IL6是炎症性细胞因子，反应了机体对炎症及感染时的反应状态，而慢性胆囊炎患者的胆汁和血清中IL6呈现高表达状态[17]。

潜在治疗靶点涉及凋亡过程的负调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、神经元凋亡过程、积极调控成纤维细胞增殖等生物过程；核、基底外侧质膜、细胞质等细胞组成；类固醇结合、染色质结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合等分子功能。通路分析结果显示，薄荷治疗慢性胆囊炎的靶点主要涉及Pathwaysincancer、prostatecancer、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications、PI3K-Aktsignalingpathway、Breastcancer、HIF-1signalingpathway等信号通路。

综上所述，应用网络药理学的方法研究薄荷治疗慢性胆囊炎的潜在作用机制，从而探明了薄荷在治疗慢性胆囊炎的作用靶点及信号通路，并明确了薄荷通过多种活性成分对多种靶点发挥其治疗慢性胆囊炎的作用机制，这为后续薄荷在慢性胆囊炎治疗上的应用提供了方向。