菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

李文静，孙艳香，付亚娟，苏彦苹，王聪艳，侯晓强，张新业

（1.廊坊师范学院 生命科学学院，河北廊坊 065000；2.河北省动物多样性重点实验室，河北廊坊 065000；3.廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室，河北廊坊 065000）

类黄酮（又称黄酮类化合物）是植物中广泛存在的一类具有重要生物功能的次级代谢产物，种类繁多，且生理作用广泛［1］。类黄酮合成通过苯丙醇和聚酮途径，起始阶段为1分子香豆酰辅酶A 和3分子丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）缩合形成柚皮素查尔酮（naringenin chalcone），该产物经过多步酶促反应生成类黄酮和花青素［2-4］。查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）属于III型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS），是植物聚酮合酶超家族中最具代表性的一员，是黄酮／类黄酮合成过程中的第一个关键酶、限速酶。1983年首次从欧芹细胞悬浮培养物中获得CHS 基因的cDNA 序列，此后多种植物中的CHS 基因陆续被克隆［5-6］。CHS参与植物生长发育，此外CHS基因在胁迫条件下能够被诱导表达，引起黄酮和植保素的聚集，从而参与水杨酸防御途径［7］。不同物种的CHS 基因序列较为保守，多数基因含有2个外显子和1个内含子；内含子存在位置相对保守，但其长度在不同的物种间变化较大；第1外显子通常编码37～64个氨基酸残基，第2外显子大约编码340个氨基酸残基，且第2外显子较第1外显子具有更高的保守性，编码了几乎所有的活性位点［8］。

菊芋为菊科（Asteraceae）向日葵属（Helianthus）多年生草本植物，原产于北美，17世纪传入欧洲，由于其耐寒耐旱，适应性强，现已引种到世界许多国家和地区［9-10］。由于菊芋对于改良盐碱土地、修复油田污染土地以及煤矿开采方面具有重要作用，近年来在山西、黑龙江、山东、江苏等省规模种植，且已经取得显著的经济、生态和社会效益［11］。菊芋用途广泛，块茎中含有丰富的糖分和菊粉，可供食用，地上部分茎秆可作动物饲料［12］；菊芋在抗菌、调节肠道功能、抗肿瘤等方面也具有一定的药用价值［13］；此外，菊芋还可作为生物燃料和造纸工业的原料［14-15］。菊芋中黄酮类物质含量较丰富，尤其是在叶片中，这对于菊芋的抗氧化活性至关重要［16］。目前对菊芋的研究主要集中在品 种 选 育［17-19］、栽 培 引 种［20］、菊 糖 提 取 工 艺 优化［21］及非生物胁迫等方面［22］，关于菊芋中类黄酮代谢途径基因克隆鲜见报道。

鉴于CHS 在类黄酮合成途径中的重要作用，本研究拟以菊芋为材料，根据同源克隆，获得HtCHS 基因序列，设计引物分别对其DNA 和cDNA 序列进行扩增，通过克隆、测序及比对，获得其基因结构；通过生物信息学分析，预测其编码蛋白的理化性质、高级结构和系统进化地位；通过实时荧光定量PCR 技术分析其组织表达部位和诱导表达情况；构建原核表达载体pET-28acHtCHS并进行原核诱导表达。该研究可为后续利用该基因调控菊芋黄酮类成分的生物合成，实现优质高产的菊芋品种选育研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验采用的菊芋‘廊芋8号’种植于河北省廊坊市思科农业技术有限公司育种基地，采集其根、茎、叶片及块茎，液氮速冻，用于组织表达模式分析。取苗期菊芋，分别置于水、20%PEG 6000和150mmol·L-1NaCl中胁迫处理0、6、12、24 h，总计12个处理，每个处理3个重复，取叶片液氮速冻，用于诱导表达分析。大肠杆菌（Escherichia coli T.Escherich）菌株Tran10 和BL21（DE3）购自北京全式金生物公司；pET-28a载体由植物分子遗传学实验室保存；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒、RNAprep pure试剂盒购自天根生物技术有限公司；DNA提取试剂盒购自艾德莱公司；GoScriptTMReverse Transcription System 购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、卡那霉素、IPTG 均购自大连宝生物公司（TaKaRa）；Ligtaion high购自东洋纺公司；引物合成和基因测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2 菊芋总RNA提取及cDNA 的合成

菊芋不同组织部位及不同处理材料总RNA提取采用RNAprep pure试剂盒，利用DNaseI去除基因组后，经10g／L 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完 整 性、NanoDrop 2000c检 测RNA 浓 度和纯度；之后使用RNA 进行第一链cDNA 合成，按 照GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒说明书进行，―20 ℃保存，备用。

1.3 菊芋基因组DNA 提取

参照艾德莱CTAB植物基因组DNA 快速提取试剂盒说明书提取菊芋叶片DNA，利用RNase去除RNA 后，经10g／L琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c对DNA 完整性、浓度和纯度进行检测。

1.4 HtCHS 基因cDNA及gDNA序列的克隆

根据GenBank中收录的向日葵、野菊花、甘菊、菜蓟、紫背天葵菜CHS 基因序列及原核表达载体pET-28a多克隆位点，设计1对含有酶切位点引物CHS7peF 和CHS7peR（表1）。分别以cDNA 和gDNA 为 模 板 进 行PCR 扩 增，反 应 程序采用降落PCR（touch down PCR），95 ℃预变性5min；95 ℃变性30s，65～55 ℃退火30s（每个循环降1 ℃），72 ℃延伸50s，10个循环；95 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72 ℃延伸5min。10g／L 的琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的片段，并连接pTOPO 平末端载体，经酶切鉴定，得到重组质粒pTOPO-BcHtCHS和pTOPO-B-gHtCHS，送测序。

1.5 HtCHS 基因结构分析

将测序获得的gDNA 和cDNA 序列提交https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／网站进行比对，确定外显子、内含子位置及个数。

1.6 HtCHS的生物信息学分析

利 用ExPASy ProtParam tool 工 具 预 测HtCHS编码氨基酸的相对分子质量、等电点（pI）及疏水性；利用Signal P 3.0Server进行信号肽预测；利用TMHMM Server 2.0 进行蛋白跨膜区预 测；利 用NCBI 网 站 上 的CDD（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）分析HtCHS蛋白保守域。利用PredictProtein方法和SWISS-MODEL 软件预测其二级和三级结构。在NCBI数据库中检索与HtCHS同源性较高的同源序列，并下载相似性较高的10种植物的CHS序列，利用Culstal Omega（https：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalo／）和Genedoc（http：／／www.ch.embnet.org／software／BOX＿form.html）进行多重序列比对。然后用MEGA 6.0进行系统发育分析（Maximum Likelihood Tree，Bootstrap 1 000次重复检验各分支的置信度），分支处的数字表示该分支分析的可靠程度，数值越大，可信度越高。

1.7 HtCHS 重组质粒的获得与鉴定

将pTOPO-B-cHtCHS 和pET-28a 分 别 使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，10g／L 琼脂糖凝胶电泳检测，纯化目的基因片段和pET-28a载体骨架。回收产物利用Ligation high进行连接，转化大肠杆菌Tran10 感受态细胞，选取阳性克隆，提取质粒，进行双酶切鉴定，正确的送美吉公司测序，获得的重组原核表达载体命名为pET-28a-cHtCHS。

1.8 HtCHS 基因在大肠杆菌中的诱导表达

利用热激法将重组质粒pET-28a-cHtCHS转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，阳性克隆过夜摇菌，次日按1∶100的比例转接到新鲜的LB培养基中，37 ℃培养至OD600值达到0.6左右，加入IPTG 至终浓度0.5 mmol·L-1，37 ℃分别诱导0、1、2 和4h，取200μL 菌液，12 000 r·min-1离心收集菌体，加入40μL 5×SDSPAGE蛋白上样缓冲液，混匀后100 ℃加热10 min，12 000r·min-1离心2min，取10μL上清液上样进行SDS-PAGE（5%浓缩胶和12.5%分离胶）电泳检测。

1.9 HtCHS 的组织特异性及胁迫诱导分析

根据HtCHS 基因和内参基因序列，应用Primer 5.0软件设计实时荧光定量RT-PCR 引物，信息见表1，内参基因为菊芋26SrRNA（Gen-Bank登录号KT179742.1）［23］。采用实时荧光定量PCR 检测系统分析HtCHS 相对表达量。实时定量RT-PCR 反应体系为25μL，具体参照2×Sybr Green qPCR Mix（Low ROX）说明书。实时定 量RT-PCR 程 序 为95 ℃、3 min；95 ℃、10s；63℃、10s；72℃、20s；40个循环；最后设置溶解曲线分析程序。试验设置3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算不同组织表达部位、不同处理及对照样品中的表达量。采用SPSS 13.0进行差异显著性分析。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 HtCHS 基因开放阅读框（ORF）的克隆

根据向日葵CHS 同源序列，从菊芋叶片中，RT-PCR 扩增HtCHS 基 因，得到一条1 197bp基因片段（图1，小条带测序结果表明为非特异性扩增）。将PCR 产物与pTOPO 平末端载体进行连接，转化，选取阳性克隆进行菌落PCR 扩增，得到一条与ORF 全长大小一致的片段（图2）。进一步对重组质粒进行双酶切验证，酶切获得1 865bp载体片段和1 197bp基因片段（图3）。综上所述，HtCHS（登录号为MN124515）编码398个氨基酸，成功获得重组质粒pTOPO-BcHtCHS。以DNA 为模板，使用CHS7peF 和CHS7peR 引物进行PCR 扩增，获得全长1 567 bp DNA 片段，包括一个大小为370bp 的内含子。gDNA 和cDNA 扩增电泳图和内含子位置见图1和图4。

图1 HtCHS 基因的PCR 与RT-PCR扩增产物Fig.1 PCR and RT-PCR products of HtCHS

图2 pTOPO-B-cHtCHS菌液PCR 产物检测Fig.2 Clonal PCR detection of pTOPO-B-cHtCHS

图3 pTOPO-B-cHtCHS载体双酶切鉴定图Fig.3 Digestive detection of pTOPO-B-cHtCHS plasmid

2.2 HtCHS的生物信息学分析

2.2.1 HtCHS蛋白质序列分析 利用ExPASy ProtParam （https：／／web.expasy.org／protparam／）在线分析HtCHS蛋白的序列组成和理化性质。HtCHS相对分子质量为43 601.44，pI为6.33，分子式为C1938H3097N521O573S23，半衰期为30h。不稳定指数为38.66，脂肪族指数为88.97，总平均疏水性为-0.071。该蛋白由20种氨基酸组成，含量最高的3 位分别是亮氨酸（9.5%）、甘氨 酸（9.3%）和 谷 氨 酸（7.8%）（图5）。HtCHS 蛋白保守结构域预测表明HtCHS氨基酸序列中含有查尔酮合成酶保守结构域，属于查尔酮合成酶超家族成员（图6）。信号肽预测结果表明HtCHS 序列中无明显的信号肽序列；蛋白跨膜区预测结果表明HtCHS无典型的跨膜区，属于非分泌蛋白；二级结构预测结果表明该蛋白α-螺旋（H）占40.45%，延伸链占10.05%，无规卷曲（C）占49.5%。利用Swiss-Model Workspace以6dxb.1为模板预测HtCHS蛋白的三级结构，与拟南芥查尔酮合成酶基因编码蛋白序列一致性为85.17%，全局模型质量评估值为95%，说明该预测结果准确（图7），且与二级结构预测结果一致。

图5 HtCHS氨基酸组成Fig.5 Amino acid composition of HtCHS

图6 HtCHS蛋白保守域分析Fig.6 Prediction of the conserved domain in HtCHS

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 经Clustal Omega比对分析，菊芋HtCHS蛋白序列与其他植物的CHS序列具有较高相似性（图8）。图8中不同灰度代表HtCHS 氨基酸与其他植物中CHS氨基酸的同源程度，黑色区域代表同源程度高达100%。菊芋CHS（MN124515）氨基酸序列保守性极强，与向日葵（Helianthus annuus，XP＿022009667.1）、松 果 菊（Echinacea pallida，APO10381.1 ）、大 丽 菊（Dahlia pinnata，BAJ14519.1）、莴 苣（Lactuca sativa，XP ＿023735557.1）、熊 胆 草（Eschenbachia blinii，AHN85848.1）、菊花（Chrysanthemum x morifolium，ABF69124.1）、北 野 菊（Chrysanthemum boreale，AGU91424.1）、山 茱 萸 变 种（Cynara cardunculus var.Scolymus，XP＿024970907.1）、紫背 菜（Gynura bicolor，BAJ17656.1）、青 蒿（Artemisia annua，PWA65027.1）的CHS 蛋白质 的相似度分别为99.25%、96.48%、93.97%、93.22%、93.47%、92.95%、92.46%、91.46%、92.21%和91.96%，其保守性可能与其在植物体内的功能有关。最大似然法系统发育分析显示，菊芋CHS蛋白与向日葵聚在一个分支，与其他物种（松果菊、大丽菊、莴苣、熊胆草、菊花、北野菊、山茱萸变种、紫背菜、青蒿）CHS 蛋白未聚在一个分支，亲缘关系均较远（图9）。

图7 HtCHS蛋白三级结构预测Fig.7 3Dstructure prediction of the HtCHS protein

图8 HtCHS与其他植物中CHS氨基酸序列的同源性Fig.8 Multiple sequence alignment of HtCHS with CHS from other plants indicated

图9 HtCHS与相关物种CHS蛋白的系统发育分析Fig.9 Phylogentic analysis of HtCHS and relative CHS proteins

2.3 HtCHS蛋白的原核表达

2.3.1 HtCHS 基因原核表达载体的构建 将pTOPO-B-cHtCHS与原核表达载体pET-28a进行酶切连接，通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定（图10）及测序，将正确的克隆转入感受态细胞BL21（DE3）中。

2.3.2 将pET-28a-cHtCHS 转入表达菌株BL21（DE3）中进行原核表达 菌落PCR 检测含有重组质粒pET-28a-cHtCHS的BL21（DE3）菌落，在0.5 mmol·L-1IPTG 条件下，37 ℃分别诱导0、1、2、4h，如图11所示，pET-28a-cHtCHS经诱导后获得一条与预期蛋白一致（43.61ku）的特异性条带。蛋白表达量随诱导时间的增加而增多，在4h 时达到最高水平（图11）。结果表明pET-28a-cHtCHS载体构建成功，并通过IPTG诱导成功获得了目的蛋白。

图10 pET-28a-cHtCHS双酶切检测Fig.10 Digestive detection of pET-28a-cHtCHS plasmid

图11 原核表达HtCHS的SDS-PAGE电泳检测Fig.11 SDS-PAGE analyses of the recombinant HtCHS protein

2.4 HtCHS 表达分析

应用实时定量RT-PCR 分析HtCHS 基因在菊芋不同组织和叶片经干旱、高盐处理之后的表达情况。结果表明，HtCHS 在根中表达量最高，其次是块茎、茎和叶片（图12）。与对照相比，150mmol·L-1NaCl和20%PEG6000处理6h时HtCHS 表达显著上调（P＜0.05），处理12h时显著下降（P＜0.05），处理24h 时，表达量无显著差异（图13）。

图12 HtCHS 在菊芋不同组织部位的表达Fig.12 Expression of HtCHSin different tissues of Helianthus tuberosus

图13 不同胁迫条件下叶片HtCHS 基因表达Fig.13 Expression of HtCHSin leaves under different stress

3 讨 论

查尔酮合成酶是调控次生代谢产物类黄酮合成的关键酶，能够催化香豆酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 生成柚皮素查尔酮。该产物在其他酶的协同作用下合成一系列黄酮类化合物。植物体内黄酮类物质的积累与查尔酮合成酶的活性及表达量相关，提高CHS 基因的表达量可以增加菊芋体内黄酮类物质的积累量。因此，克隆菊芋CHS基因并分析其在不同组织、不同胁迫处理条件下的表达量水平有望在分子水平上调控黄酮物质的合成。

CHS广泛存在于各种植物中，目前各物种中均可分离到数量不同的CHS 基因［24］。本研究成功克隆到HtCHS 基因的ORF及基因组序列，基因结构分析表明该基因含有2个外显子和1个内含子，第一外显子编码62个氨基酸残基，与之前报道结果相吻合［15］。CHS 在不同物种间的基因序列长度差异较小，同源性较高，蛋白序列高度保守［25］。王旭等［26］对比黄秋葵与其他植物CHS序列的同源性，发现黄秋葵与黄蜀葵、掌叶槭、山茶、蝶豆、陆地棉、草莓CHS 序列同源性均达90%以上，其中与黄秋葵同源性最高为99.23%。本研究得到的菊芋CHS序列与其他植物的CHS序列相似性极高，与同属向日葵（XP＿022009667.1）的同源性高达99.25%，表明其确为CHS 基因，推测HtCHS与它们亦有相似的功能，对类黄酮合成至关重要。系统进化树分析表明HtCHS蛋白与向日葵CHS 聚于一个分支，物种间系统发育关系与已知的分类学地位相符合。跨膜结构域预测表明该蛋白无跨膜区，为可溶性蛋白。同时对HtCHS 基因进行原核表达，为后续的蛋白纯化、体外酶学分析、蛋白结晶解析等奠定了理论基础。为了进一步验证菊芋查尔酮合成酶是否具有活性，将进行植物表达载体构建，侵染拟南芥查尔酮合成酶缺失突变体tt4，观察其是否能够回复该酶缺失的表型。

CHS 基因家族是由8～10个成员组成的多基因家族，CHS 基因在植物不同部位的表达特性有所不同［27］。本研究分析了菊芋不同器官中HtCHS 基因的mRNA 表达水平，该基因在根、叶、茎、块茎中均有表达，在根中表达量最高，这与黄芩中CHS 基因表达模式一致［28］。使用150 mmol·L-1NaCl和20%PEG 6000处理苗期菊芋后，HtCHS 表达水平立即增加，在处理后6h达到对照水平的13.57 倍和18.42 倍，随之在12h分别下降至4.78倍和3.34倍，处理后24h与对照相比均无明显变化。这表明HtCHS 参与盐胁迫和干旱响应。人参CHS1 参与 水杨酸、茉莉酸甲酯介导的防御反应，但是对脱落酸和NaCl 处 理 没 有 产 生 明 显 反 应 不 一 致［29］。HtCHS 参与盐胁迫和干旱反应结果与人参CHS1 不参与盐胁迫结果不同，有可能与CHS为一基因家族，菊芋与人参克隆的不是同一基因，或者进行胁迫处理时菊芋选择叶片作为材料，而人参选择发根作为材料有关。

近年来菊芋备受关注，但由于其为六倍体，基因组测序困难，目前尚无公开的基因组序列，无法通过生物信息学手段分析菊芋基因组中具体存在多少个查尔酮合成酶编码基因；虽然笔者在扩增时候发现有非特异性条带出现，将其测序之后发现非特异性条带并不是查尔酮合成酶基因序列。本研究成功从菊芋叶片中克隆了HtCHS，对其进行生物信息学、组织特异性表达及胁迫诱导表达分析，并构建原核表达载体，成功诱导表达了该蛋白，对进一步实现菊芋及类似以类黄酮为主要活性成分植物的遗传改良、品质改善具有十分重要的理论意义和实践价值。下一步将纯化HtCHS 蛋白，进行体外酶活检测，同时构建HtCHS 基因的植物表达载体并进行模式植物的遗传转化，验证该基因功能，以期从分子水平上揭示HtCHS 基因表达与黄酮含量的关系。