TSA联合HSV-1对C6鼠胶质瘤细胞株细胞增殖、细胞凋亡的影响

许强华 陈新军 刘平非 谢 腾 陈晓巍 陈治军

传统的手术治疗联合术后放疗、化疗对恶性胶质瘤的治疗效果有限[1]。近年来，寻求恶性胶质瘤新的治疗方法越来越被重视。由于传统的肿瘤放疗、化疗与病毒生物疗法并无交叉耐药性，因此，可以联合传统放疗、化疗与病毒治疗，以达到协同或叠加效应[2]。 本文探讨组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑 制 剂 曲 古 抑 菌 素 A（tropicostatin A，TSA）联合野生型Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1）对体外培养的大鼠神经胶质瘤细胞（C6 细胞）增殖、凋亡的影响，为HDAC抑制剂联合溶瘤病毒生物治疗恶性胶质瘤提供参考。

1 材料与方法

1.1 C6 细胞培养 常规复苏C6 鼠胶质瘤细胞株（中科院细胞库），DMEM+10%FBS+1%双抗（美国Gibco公司），T25细胞培养瓶培养。细胞长满培养瓶表面80%～90%，0.25%胰酶（吉林省吉诺生物工程有限责任公司）消化2 min，加新鲜完全培养基终止消化，用移液器轻轻吹散细胞，收集至15 ml离心管中，1 000转/min 离心5 min，去上清，加入新鲜完全培养基吹散细胞团，细胞计数，细胞悬液按3×104/cm2移至新的培养瓶中传代。

1.2 HSV-1病毒扩增及滴度测定 接种HSV-1（武汉大学病毒研究所馈赠）悬液0.5 ml 于已铺有细胞的培养瓶培养，待80%的细胞出现病变后，反复冻融三次，通过CsCl 密度梯度离心法进行抽提、纯化HSV-1。最后通过空斑形成实验准确测定其滴度。

1.3 CCK-8 法检测C6 细胞增殖活性 细胞消化后计数并调整细胞密度为5×104个/ml。96孔板上每孔加入100 μl 细胞悬液，恒温培养箱内培养过夜。次日置换新鲜培养基。每孔培养体积200 μl，设对照组（加入等体积培养基）、TSA 组（加入0.5×10-3μmol/L TSA 处理）、HSV-1（加入10 MOI HSV-1 处理）及TSA+HSV-1 组（加入0.5×10-3μmol/L TSA 和10 MOI HSV-1 处理）共4 组，每组设5 个复孔。另设空白调零孔。培养48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液（东仁化学科技有限公司），培养箱内孵育2 h。室温平衡后，用酶标仪测定450 nm处吸光度。计算各组细胞增殖活性。

1.4 C6 细胞凋亡率的检测 同CCK-8 法制备细胞悬液及分组。培养48、72 h 后，弃去培养基，漂洗后胰酶消化，加完全培养基离心，弃上清。将细胞重悬于400 μl 结合缓冲液中，每管加入5 μl Annexin VFITC 和5 μl PI（美国BD 公司），室温避光孵育15 min，混匀，70 μm 筛网过滤，转移至流式管，1 h 内上流式细胞仪检测。

1.5 RT-PCR 检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 表达水平 取细胞样品，加入1 ml RNAiso Plus（Trizol），吹打细胞，加入200 μl氯仿，混均、离心，吸取上清至另一离心管中，加入等量的异丙醇混匀，-20 ℃沉淀，4 ℃离心，弃上清。加入1 ml 75%乙醇，4 ℃离心，弃上清，真空干燥5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解RNA 样品，RNA纯度的测定和RNA 的定量以DEPC H2O 为对照，取2 μl RNA溶液于酶标仪上检测样本浓度和质量。将RNA 样品进行逆转录反应及PCR 扩增反应。引物序列：VEGF 正义链5'-TCACCGGAAAGACCGATTAAC-3'，反义链5'-CCCTTCATGTCAGGCTTTCT-3'；内参GAPDH 正义链5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'，反义链5'-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'。1.6 免疫印迹法检测VEGF蛋白水平 将细胞样品用胰酶消化、离心、洗涤后转移至EP管中，加入200 μl的RIPA冰上裂解30 min，4 ℃离心15 min，上清转移至离心管，用BCA 法检测细胞裂解液的蛋白浓度。通过制胶，样品处理后上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，显影拍照分析。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行分析；计量资料以±s 表示，采用方差分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSA 联合HSV-1 对C6 细胞增殖活性的影响 处理48、72 h，TSA 组、HSV-1 组、TSA+HSV-1 组C6 细胞增殖活性较对照组显著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 组C6 细胞增殖活性较TSA 组和HSV-1组明显降低（P＜0.05）。见图1。

2.2 TSA 联合HSV-1 对C6 细胞凋亡率的影响 处理48、72 h，TSA 组、HSV-1 组、TSA+HSV-1 组C6 细胞凋亡率较对照组显著增高（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 组C6 细胞凋亡率较TSA 组和HSV-1 组明显增高（P＜0.05）。见图2。

2.3 TSA联合HSV-1对C6细胞VEGF表达水平的影响 处理48、72 h，TSA 组、HSV-1 组、TSA+HSV-1 组C6细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平较对照组显著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 组C6 细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平较TSA组和HSV-1组明显降低（P＜0.05）。见图3、4。

3 讨论

溶瘤病毒的溶瘤特性对治疗恶性胶质瘤具有极大潜力，并在很多基础研究及临床试验中得到了证实[3]。HSV-1为研究最早的溶瘤病毒，为了提高溶瘤病毒治疗的安全性、靶向性及溶瘤效应，目前已研发出多种基因重组HSV-1[4]。

组蛋白乙酰化调控基因表达是重要的表观遗传学修饰机制之一。研究表明，由于乙酰化的组蛋白分子电荷的改变，使染色体结构松散而增加转录因子和其它转录调节分子结合到基因启动子的机会，激活肿瘤抑制基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡[5，6]；同时也通过导致肿瘤细胞周期停滞、阻止癌基因表达抑制肿瘤细胞增殖[7～9]。

一直以来，传统的放疗与化疗的联合作用较易出现交叉耐药，导致治疗效果不理想。由于目前还没有关于肿瘤细胞对化疗和溶瘤病毒交叉耐药的报道，更重要的是，大多数情况下，对化疗抵抗的肿瘤细胞表现出对溶瘤病毒治疗的敏感[3]。本研究应用体外C6细胞模型，结果显示，TSA+HSV-1联合作用较各单一作用效果更好。这说明TSA 联合HSV-1对体外培养的C6 细胞可产生协同或叠加杀伤作用。另外，TSA+HSV-1 联合作用明显降低C6 细胞VEGF 表达式平，这提示TSA+HSV-1 联合作用抗肿瘤效应可能与降低VEGF表达有关。