黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠海马肝脏抗氧化能力的影响

李 超，杨伟伟

(1.沧州医学高等专科学校 药理教研室，河北 沧州 061001；2.沧州市中心医院 妇二科，河北 沧州 061001)

碘是合成甲状腺激素必不可缺少的微量元素[1]，机体内缺碘会导致多种甲状腺疾病，并引起心脑功能障碍、代谢功能障碍等[2,3]。黄芪作为传统补气中药，具有抗氧化、延缓衰老和促进机体代谢等多方面的药理作用[4]，通过微生物发酵制备的黄芪发酵物可以使黄芪的有效成分更加充分利用[5]。本研究旨在观察黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠所致海马和肝脏组织氧化损伤的保护作用，为该病的治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

4月龄SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(110±10)g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0002。12 h昼夜循环，饲养温度(22±2)℃，湿度(50±5)%。

1.2 仪器和试药

Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司生产)，Spectra MaxM4全波长酶标仪(美国分子公司生产)，Sigma 3K15型超速冷冻离心机(德国Sigma公司生产)，SHA-B水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司生产)，Milli-Q Academic超纯水器(美国Millipore公司生产)。

黄芪购自河北祁澳中药有限公司；过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

碘缺乏饲料购自北京小黍有泰生物科技有限公司，小麦、玉米、黄豆按30∶30∶40的比例加入适量的添加剂制成低碘饲料，其碘含量为20 μg·kg-1。

1.3 实验药品的制备

制备黄芪提取液[6,7]和黄芪发酵提取液[8,9]，将这两种剂型各稀释成高、中、低剂量(4.00、2.00、1.00 g生药·kg-1)备用。

2 方法

2.1 实验分组及造模给药

取4周龄SPF级Wistar大鼠80只，体重(110±10)g，适应性饲养1周，按体重均衡原则随机分为8组：正常对照组、模型对照组、黄芪提取液及黄芪发酵提取液高剂量(4.00 g生药·kg-1)、中剂量(2.00 g生药·kg-1)、低剂量(1.00 g生药·kg-1)组，每组雌雄各半。正常对照组大鼠全程饲以普通饲料(饲料平均碘含量300 μg·kg-1)，每日ig等体积双蒸水。其余各组大鼠饲以低碘饲料(饲料平均碘含量20 μg·kg-1)，每日ig等体积双蒸水。3个月后复制出碘缺乏大鼠甲状腺肿模型[10]。造模后，除正常对照组和模型对照组外各组大鼠均按10 mL·kg-1ig相应药物(按人的常规日剂量与体表面积折算)，每日1次，连续给药1个月，正常对照组、模型对照组给予等体积双蒸水。实验期间继续给药。

2.2 Morris水迷宫实验

给药4周后进行Morris水迷宫实验，包括4天训练实验和1天测试实验。训练实验中，每天训练4次，间隔3 min，每次训练120 s，训练时大鼠从4个不同象限面朝池壁放置，记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在120 s未能找到平台，将其放置在平台上20 s。训练实验后24 h相应药物移走平台，进行测试实验，测试时间为120 s，如大鼠120 s内未爬上平台，记为潜逃潜伏期120 s。每只大鼠测试4次，取平均值为平均逃避潜伏期，同时记录大鼠120 s内游泳总距离[11,12]。

2.3 样本采集

Morris水迷宫实验结束后24 h，各组大鼠禁食12 h，处死大鼠，迅速取出脑、肝组织，冰盒上快速小心剥离出大鼠的海马组织，分别用冰生理盐水洗去血液，用滤纸拭干称重，将所取组织保存于-80 ℃冰柜中待测。使用前取出海马和肝组织室温下解冻，加入冰冷无菌的生理盐水中，在冰盒上研磨制成10%组织匀浆待测。

2.4 大鼠海马组织CAT活力和MDA含量测定

用考马斯亮兰蛋白定量检测试剂盒进行蛋白含量的检测，依据试剂盒说明分别测定大鼠海马组织中CAT活力和MDA含量。

2.5 大鼠肝脏组织SOD、GSH-Px活性测定

用考马斯亮兰蛋白定量检测试剂盒进行蛋白含量的检测，依据试剂盒说明分别测定大鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活性。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠空间学习记忆能力的影响

表1结果可见，与正常对照组相比，模型对照组大鼠表现出明显的记忆功能障碍：在Morris水迷宫实验中，大鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，游泳总距离明显延长(P<0.01)。而黄芪及其发酵物均可不同程度地对抗碘缺乏所致空间学习记忆障碍(P<0.01或P<0.05)，其中以黄芪发酵物4.00 g生药·kg-1剂量的作用最佳。

3.2 黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠海马组织CAT活力和MDA含量的影响

碘缺乏后大鼠海马组织中CAT活力明显降低(P<0.01)、MDA含量明显增加(P<0.01)；黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠海马组织中CAT活力明显提高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量明显减少(P<0.01或P<0.05)，以黄芪发酵物4.00 g生药·kg-1剂量的作用最佳。结果见表2。

3.3 黄芪及其发酵物对碘缺乏大鼠肝脏组织SOD、GSH-Px活性的影响

与正常对照组比较，模型对照组肝脏组织内SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.01)；与模型对照组比较，黄芪及其发酵物组肝脏组织内SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.01或P<0.05)，且均呈剂量依赖性，其中以黄芪发酵物4.00 g生药·kg-1剂量的作用最佳。见表3。

组别剂量(g·kg-1)平均逃避潜伏期(s)游泳总距离(cm)正常对照组/21.95±7.39203.94±111.95模型对照组/38.59±15.18∗∗471.57±145.04∗∗黄芪423.80±12.17#261.14±95.76##黄芪233.09±19.50323.89±125.31#黄芪136.49±24.20430.91±106.77黄芪发酵421.42±10.02##235.75±89.96##黄芪发酵229.01±13.35296.85±93.12##黄芪发酵136.10±13.21437.14±115.05

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别剂量(g·kg-1)CAT(U·mgprot-1)MDA(nmol·mgprot-1)正常对照组/18.02±2.115.35±0.20模型对照组/11.06±1.60∗∗6.52±0.52∗∗黄芪416.40±3.97##5.63±0.49##黄芪213.97±4.006.03±0.28#黄芪111.73±3.746.43±0.37黄芪发酵417.70±4.23##5.46±0.22##黄芪发酵214.36±3.99#5.91±0.20##黄芪发酵111.87±2.976.31±0.59

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别剂量(g·kg-1)SOD(U·mgprot-1)GSH-Px(U·mgprot-1)正常对照组/251.80±3.76512.12±25.91模型对照组/227.10±5.96∗∗315.22±23.63∗∗黄芪4244.43±4.79##479.77±10.91##黄芪2234.58±7.53#381.29±16.10##黄芪1230.80±9.12323.98±14.27黄芪发酵4250.01±2.84##494.89±22.74##黄芪发酵2238.74±13.93#408.35±21.62##黄芪发酵1233.17±8.25337.20±51.91

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

自由基学说表明自由基氧化功能与抗氧化功能失调导致体内清除自由基的酶和非酶系统防御功能减退，进一步使大脑病理生理改变及神经细胞凋亡，表现为记忆功能衰退。多项研究表明[13]，大脑记忆功能与抗氧化功能密切相关。

正常条件下，甲状腺具有强大的抗氧化系统，可维持机体氧化平衡，并保护甲状腺免受氧化应激损伤。甲状腺激素的合成与代谢都伴随自由基的产生，而碘是合成甲状腺激素的必需元素，碘与甲状腺氧化损伤密切相关[14]。当机体缺碘导致甲状腺疾病时，可引起甲状腺氧化应激反应，如活性氧基团(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，这可能是碘缺乏导致甲状腺疾病的机制之一[15]。

黄芪是常用的中药材，目前临床上黄芪入药多为传统饮片，水煎煮后取滤液为药用。选用最佳的发酵工艺，提高了黄芪的药用价值[16]。研究发现黄芪及其发酵物改善碘缺乏所致学习记忆障碍作用可能与抗氧化相关。本实验结果表明黄芪及其发酵物能增加碘缺乏大鼠体质量和自主活动次数，减少大鼠平均逃避潜伏期时间及到达目的地总路程，表明其能改善碘缺乏大鼠记忆功能衰退的现象。

机体在组织和细胞中建立了一套完整的防御自由基的损伤和破坏抗氧化酶自由基损伤防御系统，CAT、MDA、SOD、GSH-Px即为其中的重要组成部分[17]。碘缺乏可造成海马组织CAT活力显著降低和脂质代谢产物MDA含量显著增加，肝脏组织SOD、GSH-Px活性显著降低，而黄芪及其发酵物可提高机体抗氧化酶的活性，使甲状腺组织免受过脂质过氧化的破坏，减轻细胞的损伤状态，进而起到保护学习记忆功能的作用。

碘缺乏损伤可引起大鼠记忆功能障碍，而黄芪及其发酵物能明显改善碘缺乏大鼠的记忆功能障碍，对氧化相关酶方面有明显的改善作用，其中尤以黄芪发酵物的作用最佳，提示黄芪发酵物有可能开发成为甲状腺疾病治疗的新型药物，可能有助于改善甲状腺功能减退的愈后，降低碘缺乏所致甲状腺功能减退的严重程度，使其更好地应用于临床。