盐知母多糖的抗炎作用研究

贾小舟，苏慧琳，曾元宁，王秋红，匡海学*

(1.黑龙江中医药大学，北药基础应用与研究教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)为百合科知母的干燥根茎。于春季和秋季采挖，除去其根须和表面附着泥沙，后晒干，习称“毛知母”；或除其外皮并晒干[1]。知母作为临床常用药材历史悠久，并且是许多常用中药复方的组成成分。知母中活性成分主要包含有甾体皂苷类、双苯吡酮类、黄酮类、有机酸类、木脂素类、多糖类和微量元素等。知母皂苷类成分以甾体皂苷的数量最多，含量最高。而知母中含有最多的成分为多糖组分，是知母的重要物质组成。以往对知母的研究大多关注了知母原药材的小分子组成,近年来国内外学者对知母糖类化合物进行了深入的研究,结果表明知母多糖具有明显的降血糖作用[2]、抗炎作用[3]、利水通便[4]和抗氧化的功能[5-6]。笔者前期研究发现知母小分子的炮制改变并不明显，而盐炙炮制后的药材产生了活性更高、分子量减少，含蛋白量较低的多糖。本文探讨盐炙后——盐知母多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用的影响，现报告如下。

1 材料

1.1 药物与试剂

盐知母多糖(自制)：取盐知母100 g，分别以8倍蒸馏水提取2次，每次2 h，过滤，滤液减压浓缩后，加95%乙醇，至乙醇终浓度为80%，静置，过滤，沉淀经无水乙醇、丙酮反复交替洗涤，干燥得盐知母多糖组分。

水合氯醛(批号：20180813);吲哚美辛肠溶片(广东华南药业集团有限公司)；大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司，批号分别为MM-0132M1、MM-0040M1、MM-0163M1)；其余试剂皆为分析纯。

1.2 动物

SPF级昆明种小鼠60只，体质量(20±2)g，购自广东省医学实验动物中心，生产合格证号44007200067823。购买动物后，在室温20 ℃～25 ℃实验室内适应性喂养1周后开始实验。

1.3 仪器

Epoch酶标检测仪(Bio TeK)；N-1300旋转蒸发仪(东京理化株式会社);GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；ME802/02电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

2 方法

2.1 二甲苯致小鼠耳肿胀实验

取昆明小鼠60只，随机分为6组，每组各10只，分为正常组(空白组)、模型组(灌胃蒸馏水)、盐知母多糖低、中、高剂量组(0.32、0.64、1.28 g/kg)和阳性药组(10 mg/kg吲哚美辛)。各组小鼠给药体积均为1.0 mL/100 g。盐知母多糖给药剂量参考《中华人民共和国药典》[1]成人每日用量，根据人体与小鼠的等效剂量折算系数换算成小鼠的剂量。每日给药1次，连续5 d。末次给药1 h以后，立即在小鼠左耳前后两面分别涂抹二甲苯100 μL致炎造模，右耳不做任何处理。

2.2 耳肿胀度的计算

致敏30 min后称重，4%水合氯醛麻醉小鼠，脱颈椎将其处死，沿耳廓剪下左右两耳片，用7 mm直径打孔器在同一部位打下圆耳片，用分析天平称分别称重，计算各组耳肿胀抑制率。

耳肿胀率(%)=[(左耳重量-右耳重量)/左耳重量]×100%

2.3 脾指数和胸腺指数

致敏30 min后称重，4%水合氯醛麻醉小鼠，脱颈椎将其处死，取脾与胸腺称重,并计算脾指数和胸腺指数。

脏器指数=脏器质量×10/体质量

2.4 HE染色及观察

剪下的小鼠左耳打孔取材称重后，立即用4%多聚甲醛固定，做石蜡切片，HE染色，光镜下观察各实验组耳组织中充血、水肿及炎症细胞浸润程度的病理变化。

2.5 小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α检测

致敏30 min后称重，4%水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，脱颈椎将其处死，取血后置于离心管中，静置至血液凝固，1 000×g离心15 min,吸出上清至1.5 mL离心管,放入-80 ℃冰箱备用,按试剂盒说明书对TNF-α、IL-1β和IL-6含量进行测定。

2.6 统计学分析

数据以均数±标准差表示，进行统计学分析。两组间均数的比较，采用配对样品t检验。以P≤0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 盐知母多糖对各组小鼠耳肿胀的影响

各实验组小鼠状态与实验前无差别，饮食饮水量基本稳定，无精神萎靡或死亡，体质量增长无明显差异。与空白组相比，模型组小鼠耳肿胀率为52.09%，与空白组比较有统计学意义(P<0.01)，提示造模成功。与模型组比较，盐知母多糖低、中、高剂量组和阳性药组，小鼠的耳肿胀率明显降低,其中盐知母多糖中、高剂量组和阳性药组具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。盐知母多糖低、中、高剂量组与阳性药组的耳肿胀率分别为45.26%，38.67%，34.06%，30.23%。给药5 d后，盐知母多糖能降低小鼠耳肿胀率，说明盐知母多糖对二甲苯所致小鼠耳肿胀模型有抗炎消肿的作用。见表1。

表1 盐知母多糖对小鼠耳肿胀率的影响

注：与空白组相比，##P<0.01;与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。

3.2 盐知母多糖对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

与空白组相比，模型组的体脏系数明显升高，具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐知母多糖低、中、高剂量组和阳性药组，小鼠的脾指数明显降低，具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较，盐知母多糖低、中、高剂量组中胸腺指数降低，其中阳性药组对胸腺指数影响明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3.3 HE染色及观察

200倍显微镜下观察小鼠左耳廓局部组织切片可直观的看出：空白组皮下结缔组织排列紧密无水肿、无炎性细胞浸润现象；模型组较空白组耳组织明显肿胀、肥大，说明造模成功；阳性药组、盐知母多糖中、高低剂量组均较模型组有不同程度的肿胀减少现象。结果显示盐知母多糖中、高剂量组有显著的抗炎作用。见图1。

表2 各组小鼠脾指数与胸腺指数比较

注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01,*P<0.05。

注：A:空白组;B:模型组;C:阳性药组;D:盐知母多糖低剂量组;E:盐知母多糖中剂量组;F:盐知母多糖高剂量组。图1 耳组织HE染色(HE，×200)

3.4 盐知母多糖对小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，表示造模成功；与模型组比较，盐知母多糖中、高剂量组均能显著降IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，且成量效关系，这也可能是盐知母多糖发挥抗炎作用的原因之一。见表3。

表3 盐知母多糖对小鼠血清细胞因子的影响

注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01，*P<0.05。

4 讨论

本文选择二甲苯为致炎因子，使小鼠耳廓局部毛细血管通透性增加，诱导耳肿胀，炎性细胞浸润，该模型操作简单，见效快且易复制成功[7-9]。通过观察盐知母多糖对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响后发现，盐知母多糖中、高剂量组对小鼠耳肿胀度较模型组能明显降低，且有药物浓度的增加，肿胀程度降低的趋势。脾是机体最大的免疫器官，是免疫反应的主要场所之一，可以制造免疫球蛋白等免疫物质，直接反映机体的免疫功能[10]。灌胃给药后，盐知母多糖低、中、高剂量组可使小鼠的脾指数明显降低,说明盐知母多糖可以降低二甲苯所致小鼠耳肿胀的免疫功能。从耳组织HE染色切片观察，同模型组相比，盐知母多糖中、高剂量肿胀程度明显降低，炎性浸润细胞减少，同时小鼠血清中免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α也明显下降，可见盐知母多糖具有抗炎消肿作用，同时改善血清中免疫因子水平，从而发挥抗炎作用。本研究为今后盐知母多糖抗炎机制研究奠定基础，为盐知母多糖的进一步研究提供一定的参考意义。