细胞色素P450 55B1的直接电化学及对一氧化氮的电催化检测

姜楠，吴云华

(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)

一氧化氮(NO)是一种理化性质十分活泼的气体小分子，具有调节动植物多种生理功能的作用[1,2].有研究表明，生物体在生长发育过程中也会产生少量 NO[3].内源性的NO作为一种信使物质，能够起到调节生理功能的作用，作用特点类似于激素，即微量的NO具有参与或调节生物体生理功能的作用，过量的NO会对机体产生毒害作用[4].因此生物体已经进化出了一系列的机制以便及时高效地产生和清除NO.内源性NO的清除机制具有多样性的特点[5,6].NO的清除机制之一依赖于NO还原酶，还原酶还原NO为N2O.CYP55B1来源于莱茵衣藻，属于细胞色素P450大家族[7].它除具有P450酶的典型特性外，还能够实现NO的催化还原，该催化反应需要NADH提供电子[8-10].戊二醛是传感器研究领域十分常用的一种同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与蛋白质或酶的氨基结合，形成酶/受体-戊二醛结合物[11].本研究基于CYP55B1催化特性，将CYP55B1和牛血清白蛋白混合，同时加入戊二醛进行交联反应，将混合物交联固定在热解石墨电极表面，构建酶生物传感器CYP55B1/GA/BSA/PGE，并成功的应用于NO的催化检测.

1 实验部分

1.1 材料和仪器

大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)及原核表达载体pET-28a(+)、pET-28a-55b1均由中南民族大学生命科学学院生物医学分析团队提供.限制性内切酶EcoR I、Hind III(Takara公司)；琼脂糖凝胶电泳Marker(东盛生物)；蛋白质分子量Marker(Thermo)；30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(摩尔比为29∶1)储备液、卡那霉素(上海生工)；镍亲和纯化柱(康为世纪)；异丙醇δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Alfa Aesar公司；其他试剂均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司；一氧化碳气体(CO)和氮气(N2，99%)购自武汉翔云公司，NO溶液参照文献[12]制备，制备得到的NO母液浓度为1.8 mmol·L-1，避光密闭保存在带有橡皮塞的棕色玻璃瓶中.

电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-6D)；紫外-可见分光光度计(美国Perkin Elmer，Lambda 750)；CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器)；标准三电极体系：CYP55B1/GA/BSA/修饰的热解石墨电极为工作电极，甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝为对电极.

1.2 蛋白质的诱导表达与纯化

通过热激转化法将载体pET-28a(+)和pET-28a-55b1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，平板活化，挑取单菌落接种至5 mL含有30 μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中，37 ℃，180 r·min-1，培养12 h，随后转接至50 mL TB培养基(含有30 μg·mL-1卡那霉素)中，37 ℃，180 r·min-1，扩大培养2 h，至OD值约为0.6，向培养基中加入终浓度为0.5 mmol·L-1ALA、1 mmol·L-1IPTG，28 ℃、160 r·min-1培养22 h.

4 ℃、3200 g离心收集菌体，菌体置于冰上预冷后使其停止蛋白表达.加入6 mL Tris裂解液(pH值8.0，20 mmol·L-1Tris-HCl + 500 mmol·L-1NaCl)重悬菌体, 加入100 μL溶菌酶(10 mg·mL-1)冰上孵育40 min，反复冻融3次，超声破碎菌体.4 ℃、13000 g离心20 min，收集上清液，过0.22 μm滤膜后，过镍亲和柱纯化.冰上孵育结合1 h后，依次用50、100、150、200、250 mmol·L-1咪唑洗脱液(pH值8.0，含20 mmol·L-1Tris-HCl、500 mmol·L-1NaCl)梯度体积洗脱杂蛋白，并收集每一步的最后1 mL流出液，最后5 mL 500 mmol·L-1咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，收集所有洗脱液，经超滤管浓缩，用于后续实验[13].

1.3 细胞色素P450 55B1的CO差示光谱测定

采用CO差示光谱法对CYP55B1进行定量分析[14].取5 mL测定液和1 mL的P450蛋白液样品混匀，加入100 μL 0.5 mmol·L-1连二亚硫酸钠，混匀后于冰上静置1 min，将上述溶液等量一分为二，分别加入到两个比色皿中，在400～500 nm波长范围内扫描进行基线校准，向其中一个比色皿中缓慢的通入CO气体1 min，冰上放置反应1 min后，在400～500 nm波长范围内扫描，得到还原型CYP55B1与CO形成复合物的紫外光谱.

1.4 细胞色素P450 55B1修饰热裂解石墨电极的制备

麂皮材料上添加少量0.05 μm的氧化铝粉末，用二次蒸馏水浸润，热解石墨电极(PGE，直径3 mm)于麂皮材料上顺时针方向抛光，无水乙醇中超声波清洗1次，二次蒸馏水中超声清洗2次，每次3 min，室温晾干，取10 μL修饰液[3 μL 2.5%戊二醛(GA)溶液、3 μL 2.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)和4 μL CYP55B1蛋白样品，混合均匀]滴涂在热解石墨电极表面，4 ℃交联固定过夜，得到CYP55B1修饰热裂解石墨电极(CYP55B1/GA/BSA/PGE).不含有CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/PGE)作为对照.

1.5 CYP55B1/GA/BSA/PGE检测NO

电解池中加入5 mL 0.1 mol·L-1的PBS溶液(pH7.0)，氮气除氧20 min，保持氮气氛，将三支电极置于检测池，不断地加入NO溶液，磁力搅拌子混合均匀后，进行循环伏安(CV)扫描检测，扫速为0.5 V/s.

1.6 CYP55B1催化NO机理验证

向1.5中的溶液中不断加入NO溶液，直至该催化反应达到饱和状态后，向反应池中不断地加入母液浓度为1.8 mmol·L-1的NADH溶液，磁力搅拌子混合均匀，进行循环伏安扫描.

1.7 CYP55B1/GA/BSA/PGE的选择性

将修饰电极放入装有电解池中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的PBS溶液(pH7.0)，通氮除氧20 min，分别加入不同浓度的干扰物质谷胱甘肽(GSH)、氯化铵(NH4Cl)、亚硝酸钠(NaNO2)、L-精氨酸(L-Arg)、双氧水(H2O2),采用循环伏安法(CV)进行电化学检测，扫速为0.5 V/s,重复试验3次.

2 结果与讨论

2.1 蛋白纯化SDS-PAGE分析

对CYP55B1表达纯化各步骤样品进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示：第1、2泳道是重组菌超声破碎离心的沉淀和上清液；第3泳道为镍柱流出液，可见待纯化样品与在镍亲和纯化柱冰上孵育结合后，由于杂蛋白与填料结合不牢固，直接流出；第4～9泳道是咪唑的梯度洗脱液，少数杂蛋白被梯度浓度咪唑缓冲液洗脱下来，最后经高浓度500 mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱得到纯度较高的目的蛋白，且其分子量大小48 kDa, 与理论预测的CYP55B1大小一致.实验结果表明：CYP55B1表达纯化成功，可用于后续的传感器的构建.

M)Marker；1)诱导表达22 h重组菌破碎离心沉淀；2)诱导表达22 h 重组菌破碎离心上清液；3)流出液；4～9)50、100、150、200、250、500 mmol·L-1咪唑洗脱

2.2 CYP55B1的CO差示光谱测定

重组菌样品破碎后4 ℃、10000 g离心20 min的上清液、沉淀以及500 mmol·L-1咪唑洗脱液的样品进行CO差示光谱测定，结果如图2所示.测定各组分均具有P450特征性的紫外吸收峰，证明了CYP55B1成功诱导表达及纯化，且纯化后的蛋白样品仍具有活性.代入公式[13]，计算得到纯化后CYP55B1的浓度为0.075 nmol·L-1.

图2 CYP55B1纯化CO差示光谱

2.3 CYP55B1的直接电化学

在-1.2～0.1 V范围内，扫速为0.5 V/S，对CYP55B1修饰热裂解石墨电极进行循环伏安扫描.如图3所示：不含CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/PGE)，在扫描范围内，无任何氧化还原峰；而 CYP55B1修饰热裂解石墨电极(GA/BSA/CYP55B1/PGE)，有一对峰形较好的氧化还原电流峰，其氧化峰电位位于-0.355 V，还原峰电位位于-0.385V，氧化还原峰电位差值ΔEp为30 mV.结果表明：CYP55B1在热裂解石墨电极表面实现了直接电化学，其活性中心的卟啉铁与电极之间实现了直接电子传递，电位高于-0.355 V,卟啉铁为+3价的氧化态，电位低于-0.385 V，卟啉铁为+2价的还原态.

图3 GA/BSA/PGE和GA/BSA/CYP55B1/PGE的循环伏安图

考察测定液pH值对CYP55B1直接电化学的影响，将修饰电极GA/BSA/CYP55B1/PGE置于不同pH值的0.1 mol·L-1PBS溶液中，进行循环伏安扫描，结果如图3a所示.CYP55B1特征还原峰峰电位随着缓冲溶液pH值的改变而发生一定程度的迁移，由此得到图4b，即还原峰电位与缓冲液pH值的关系图，还原峰电位与缓冲液pH值成反比关系，缓冲液的pH值越高，还原峰电位越低.

图4 GA/BSA/CYP55B1/PGE在不同pH值的循环伏安曲图(a)CYP55B1还原峰电势与pH值线性关系图(b)

2.4 CYP55B1催化还原NO

CYP55B1修饰热裂解石墨电极放入PBS溶液，得到了其活性中心卟啉铁的氧化还原峰峰.不断地向测定池中加入NO溶液，磁力搅拌混合均匀后进行循环伏安扫描，结果如图5所示：随着NO的不断加入，-0.85 V处的还原峰电流在不断升高，同时伴随-0.35 V处还原峰电流不断降低，加入NO到一定浓度后，-0.85 V处的还原峰电流和-0.35 V处还原峰电流不再发生变化(2～11).NO与CYP55B1活性中心的卟啉铁的铁离子结合形成复合物，该复合物从电极得到一个电子，发生还原，还原峰电位位于-0.85 V，同时由于卟啉铁的自由铁离子减少，-0.35 V处还原峰电流不断降低.由于固定于电极表面的细胞色素P450 55B1的量一定，所以加入一定浓度NO后，CYP55B1与NO的结合达到饱和，-0.85 V处的还原峰电流和-0.35 V处还原峰电流不再发生变化.

1～11：NO浓度分别为0、3.6、10.8、18、25.2、32.4、39.6、46.8、54、61.2、68.4 μmol·L-1

如图6所示，NO的浓度在14.4～108 μmol·L-1范围内，还原峰电流增大值与加入NO的浓度之间呈现线性关系，线性回归方程为：y=0.01696x-0.03447(R2=0.9766)，检测限(LOD)为10.47 μmol·L-1.

图6 不同浓度NO与复合物电流差值的线性关系图

2.5 CYP55B1/GA/BSA/PGE催化NO机理验证

CYP55B1修饰热裂解石墨电极放入PBS溶液，不断地向反应池中加入NO溶液，直至-0.85 V与-0.35 V处峰电流不再发生变化(1)，此时CYP55B1与结合达到饱和，再依次向反应池中加入母液浓度为1.8 mmol·L-1的NADH溶液，混合均匀后进行循环伏安扫描，结果如图7所示：随着溶液中NADH浓度不断地增大，-0.35 V处还原峰电流在逐渐升高(2-11)，表明在NADH不断提供电子的作用下，CYP55B1不断催化与其结合的NO还原为N2O，N2O离开CYP55B1的卟啉铁，自由的卟啉铁离子在电极表面发生还原，导致-0.35 V处还原峰电流的不断升高，符合细胞色素P450 55B1催化NO的还原反应机理.

1～11：NADH浓度分别为0、3.6、10.8、18、25.2、32.4、39.6、46.8、54、61.2、68.4 μmol·L-1

2.6 CYP55B1/GA/BSA/PGE的选择性

选取谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化铵、亚硝酸钠及双氧水5种物质来验证该检测方法的选择性.这几种物质在生物体内存在较普遍，在检测实际样品时可能会以干扰物质的形式存在，且谷胱甘肽和L-精氨酸可作为生物体合成NO的底物.在相同的实验条件下，加入干扰物质的浓度与NO的浓度相同，混合均匀后进行循环伏安扫描，重复3次.为了便于分析，选取NO、亚硝酸钠、双氧水、L-精氨酸、谷胱甘肽、氯化铵的浓度分别为18、36、54、72 μmol·L-1时-0.85 V处还原峰电流增加值进行对比，结果如图8所示.由图可知：浓度为18 μmol·L-1时，其它物质的峰电流增加值均较低，相较之下，NO对应的峰电流增加值较大.浓度为36 μ mol·L-1时，谷胱甘肽、L-精氨酸、氯化铵的电流差值为负值，NO的峰电流持续增加了近一倍，且随着浓度的不断升高，峰电流在不断地上升，而其他物质对应的电流值并不具有规律性的变化.该结果表明，CYP55B1能在电极表面催化NO，但对其他常见含氮物质或强氧化物不具有催化活性，该检测技术具有特异性.

图8 CYP55B1-BSA-GA修饰热解石墨电极的选择性

3 结语

本研究将构建成功的原核表达载体pET-28a-55b1通过热激转化法转化到大肠杆菌BL21(DE3)，以β-半乳糖苷作为诱导剂，成功实现了CYP55B1的异源原核表达.通过超声破碎及镍亲和柱层析技术，对CYP55B1进行提取和纯化，最终得到了具有P450活性的CYP55B1.通过戊二醛和BSA共价交联技术将CYP55B1蛋白固定于热解石墨电极表面，利用CHI660电化学工作站，实现了NO的直接电化学检测以及CYP55B1催化NO的机理验证，并探讨了该检测方法的特异性.结果表明：CYP55B1具有P450nor的特性，能够催化NO的还原，且该催化反应需要NADH的参与，CYP55B1及其催化形成的复合物均具有电化学信号，能够实现NO的直接电化学检测.本研究利用这一催化反应机理，并基于酶促反应具有专一性强，灵敏度高的特点，开发了一种NO的检测技术，该检测技术只对NO具有响应，而对于一些在机体内产生NO的前体物质如谷胱甘肽不具有电化学响应.后续拟通过进一步探究和改进，有望将该检测技术应用到实际样品的检测，提高其实用性.