不同发酵条件对荔枝产香菌发酵茶品质的影响

马煜明，玉 云，朱 雯，高玉佩，黄友谊

(1.华中农业大学 园艺林学学院， 武汉 430070；2.贵州省贵阳市乌当区农业农村局，贵阳 550000)

黑茶是中国传统六大茶类之一，有着悠久的生产和饮用历史。近年来，随着大众养生观念的加深，黑茶消费市场日益扩大[1-2]。黑茶渥堆发酵是由湿热反应、微生物酶催化、微生物代谢共同作用完成。发酵过程以微生物作用为主导，形成黑茶的特殊风味品质[3-4]，因此微生物对黑茶品质的形成起关键性作用，且微生物种类不同会导致黑茶品质呈现显著差异。目前，黑茶依然依赖于自然发酵生产，但发酵过程存在微生物种类不可控、卫生安全问题突出、茶叶品质不稳定等问题，迫切需要改进提升[5-6]。人工接种优良菌株可促进黑茶安全生产和优良品质的形成，但发酵工艺条件因菌株的不同而异[7-9]。已有的研究表明，荔枝产香菌能显著改善发酵烟叶的品质[10]，为此，本研究基于课题组前期已筛选获得适宜发酵茶叶的荔枝产香菌基础上，分析不同发酵条件对荔枝产香菌发酵茶品质的影响，以优化发酵工艺，为清洁化安全生产黑茶和开发新颖黑茶产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

ZYF3为华中农业大学茶学系茶叶加工与生物技术课题组从荔枝中筛选出来适宜于茶叶发酵的优势产香酵母菌株，青砖茶原料(绿毛茶)购自湖北洞庄茶业有限公司。葡萄糖、福林酚、甲醇、碳酸钠、浓硫酸、磷酸氢二钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 菌种液制备 ZYF3菌株接种于10 mL、20 g/L质量浓度的茶汤中，于28 ℃、150 r/min摇床中振荡培养5～6 d，得菌种液，用于接种发酵绿毛茶。

1.2.2 不同条件下发酵荔枝产香菌茶 (1)不同接种量下发酵产香菌茶：绿毛茶以20 g/瓶的标准装瓶，121 ℃高温灭菌20 min。在超净工作台内用移液枪吸取一定量的荔枝产香菌菌种液接种于灭菌茶样中，菌株接种量设为0.9%、1.0%、 1.1%、1.2%、1.3%和1.4%(mL/g，菌种液体积/茶叶质量)，用无菌水补充水分，使茶坯最终含水量控制在40%，于28 ℃恒温箱中发酵10 d，发酵结束后用40 ℃烘箱烘至足干，得发酵茶样。

(2)不同茶坯含水量下发酵产香菌茶：绿毛茶以20 g/瓶的标准装瓶，121 ℃高温灭菌20 min。在超净工作台内用移液枪吸取1.0%(mL/g，菌种液体积/茶叶质量)的荔枝产香菌菌种液接种于灭菌茶样中，茶坯含水量设为20%、30%、40%、45%、50%和60%，用无菌水补充水分，于28 ℃恒温箱中发酵10 d，发酵结束后用40 ℃烘箱烘至足干，得发酵茶样。

(3)不同发酵温度下发酵产香菌茶：绿毛茶以20 g/瓶的标准装瓶，以121 ℃高温灭菌20 min。在超净工作台内用移液枪吸取1.0%(mL/g，菌种液体积/茶叶质量)的荔枝产香菌菌种液接种于灭菌茶样中，用无菌水补充水分，使茶叶最终含水量控制在40%，于恒温箱中发酵10 d，发酵温度设为20 ℃、25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃和45 ℃，发酵结束后用40 ℃烘箱烘至足干，得发酵茶样。

(4)不同发酵时间下发酵产香菌茶：绿毛茶以20 g/瓶的标准装瓶，以121 ℃高温灭菌20 min。在超净工作台内用移液枪吸取1.0%(mL/g，菌种液体积/茶叶质量)的荔枝产香菌菌种液接种于灭菌茶样中，用无菌水补充水分，使茶叶最终含水量控制在40%，于28 ℃恒温箱中发酵，发酵时间设为5 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d，发酵结束后用40 ℃烘箱烘至足干，得发酵茶样。

1.2.3 茶叶感官审评方法 参考GB/T23776-2018中黑茶(散茶)审评方法，由5位专业评茶员进行审评，审评时为突出茶叶香气，评分权数设置为：总分=香气得分×40%+汤色得分×20%+滋味得分×30%+叶底得分×10%。

1.2.4 茶叶理化性状测定方法 茶叶含水量的测定参照GB5009.3-2016直接干燥法，水浸出物含量的测定参照GB/T8305-2013，茶多酚含量的测定参照GB/T8313-2008福林酚比色法，游离氨基酸含量的测定参照GB/T8314-2013，可溶性糖的测定采用蒽酮比色法[11]。

1.3 数据处理

所有试验重复3次，采用 Excel 2003进行数据处理，采用SPSS软件(PASW Statistics 18.0)进行方差分析和显著性比较。

2 结果与分析

2.1 接种量对荔枝产香菌发酵茶品质的影响

2.1.1 接种量对荔枝产香菌发酵茶感官品质的影响 对不同接种量发酵的荔枝产香菌茶进行感官审评，结果见表1。由表1可知，随着接种量增加，产香菌发酵茶发酵香或菌香更加明显。当接种量为1.2%时，产香菌发酵茶香气最协调，得分最高，但不同接种量的产香菌发酵茶感官得分相互之间没有明显差异。接种量大于 1.1%时，茶汤开始出现浑浊。接种量小于1.1%时，产香菌发酵茶的涩味较重；接种量大于1.2%时，菌味越来越明显，对滋味产生明显影响，与香气结果一致。综合考虑，接种量为1.2%时，产香菌发酵茶的感官品质最好。

表1 不同接种量发酵的荔枝产香菌发酵茶感官品质Table 1 Sensory quality of tea fermented by different inoculation amounts of aroma-producing strains from litchi

2.1.2 接种量对荔枝产香菌发酵茶理化品质的影响 对不同接种量发酵的荔枝产香菌茶理化成分进行测定，结果见图1。由图1可知，不同接种量对产香菌发酵茶中水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量具有显著性影响(P<0.05)。随着接种量增加，产香菌发酵茶中水浸出物和游离氨基酸含量呈现下降-上升-下降的变化趋势，但在1.2%时二者含量均达到最高值。随着接种量增加，产香菌发酵茶中可溶性糖含量整体呈现上升趋势，而茶多酚含量呈现上下波动。综合分析，接种量在1.2%～1.3%时，利于荔枝产香菌发酵茶理化品质的形成。

不同小写字母表示0.05水平的显著性差异，下图同

2.2 茶坯含水量对荔枝产香菌发酵茶品质的影响

2.2.1 茶坯含水量对荔枝产香菌发酵茶感官品质的影响 对不同茶坯含水量发酵的荔枝产香菌茶进行感官审评，结果见表2。由表2可知，随着含水量增加，发酵茶品质整体上呈现变好的趋势。茶坯含水率为45%时茶叶汤色出现显著变化，色泽由浅变深，可能是由于物质转化程度加剧。最终根据审评结果以及黑茶实际生产发酵含水量的需要综合考虑，选择45%为最佳茶坯含 水量。

2.2.2 茶坯含水量对荔枝产香菌发酵茶理化品质的影响 对不同茶坯含水量发酵的荔枝产香菌茶理化成分进行测定，结果见图2。由图2可知，不同茶坯含水量对产香菌发酵茶样水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量均有显著性影响(P<0.05)。随着茶坯含水量增加，水浸出物、游离氨基酸和可溶性糖含量呈现上下波动的无规律变化，其中茶坯含水量为45%时，三者含量都处于较高水平；茶多酚含量呈现先减后增的趋势。综合分析，茶坯含水量为45%时，利于茶叶理化品质的形成。

2.3 发酵温度对荔枝产香菌发酵茶品质的影响

2.3.1 发酵温度对荔枝产香菌发酵茶感官品质的影响 对不同温度下发酵的荔枝产香菌茶进行感官审评，结果见表3。由表3可知，25～32 ℃条件下，茶样香气较好，尤其25 ℃下茶样略带花草香，发酵温度过高或者过低都会出现酸味，不利于茶叶品质的形成。温度小于28 ℃时，茶叶草腥味重，温度大于32 ℃时，茶汤滋味明显改善，说明在低温条件下，产香菌产生的有益茶叶滋味品质形成的物质较少。总体来看，32 ℃条件下发酵效果最佳。

表2 不同茶坯含水量发酵的荔枝产香菌茶感官品质Table 2 Sensory quality of tea fermented by aroma from litchi with different water contents in tea material

图2 不同茶坯含水量发酵的荔枝产香菌茶理化成分Fig.2 Components of tea fermented by aroma-producing litchi with different water contents in tea material

表3 不同温度发酵的荔枝产香菌茶感官品质Table 3 Sensory quality of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation temperatures

2.3.2 发酵温度对荔枝产香菌发酵茶理化品质的影响 对不同发酵温度下发酵的荔枝产香菌茶理化成分进行测定，结果见图3。由图3可知，不同发酵温度发酵茶样的水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖及茶多酚含量均有显著差异(P<0.05)。随着发酵温度增加，产香菌发酵茶中水浸出物和可溶性糖含量呈现上下波动的无规律变化，但发酵温度在32 ℃和45 ℃时两者含量都较高。同时，32 ℃下发酵茶游离氨基酸含量显著(P< 0.05)高于其他温度下发酵茶，且其他温度下发酵茶中游离氨基酸含量之间没有显著性差异(P> 0.05)。综合分析，最佳发酵温度为32 ℃。

图3 不同温度发酵的荔枝产香菌发酵茶理化成分Fig.3 Chemical components of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation temperatures

2.4 发酵时间对荔枝产香菌发酵茶品质的影响

2.4.1 发酵时间对荔枝产香菌发酵茶感官品质的影响 对不同发酵时长下的荔枝产香菌发酵茶进行感官审评，结果见表4。由表4可知，随着发酵时间增加，茶叶菌味越来越明显，而青气减少。但发酵时间大于20 d后茶叶香气变为闷味，可能是发酵时间过长，发酵罐通气性差导致。发酵 10～20 d的茶样滋味较醇和，其中发酵20 d时茶样具有菌味，与香气审评结果一致。综合考虑，最佳发酵时间为20 d，发酵时间过短或过长都不利于茶叶滋味的形成。

表4 不同发酵时间的荔枝产香菌茶感官品质Table 4 Sensory quality of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation time

2.4.2 发酵时间对荔枝产香菌发酵茶理化品质的影响 对不同发酵时长的荔枝产香菌茶理化成分进行测定，结果见图4。由图4可知，发酵时间对发酵茶水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量具有显著性影响(P<0.05)，且随着发酵时间延长，4种成分整体上都呈现降低趋势，其中可溶性糖和茶多酚含量在发酵20 d时有较大增幅。结合审评结果，发酵20 d时茶样香气和滋味中都出现菌味的现象，因此推测发酵20 d时，菌株可能利用不溶性的物质生成游离氨基酸和茶多酚。综合考虑，发酵最佳时间为20 d。

3 讨 论

3.1 不同条件对荔枝产香菌发酵茶感官品质的影响

本试验主要探究了接种量、茶坯含水量、发酵温度和发酵时间对于荔枝产香菌发酵茶品质的影响。由黑茶发酵机理可知，不同外界条件会对黑茶发酵过程产生重要影响，其品质特征会发生显著变化。由4组单因素试验结果可以看出，经工艺优化后的发酵茶其感官品质明显优于对照组，特别是发酵茶的香气品质。当产香菌接种量过多或茶叶发酵时间过长时，发酵茶会逐渐产生酸味，并且随着程度的加深酸味越明显，这可能是由于微生物的过量生长导致茶叶发酵程度过重，产生过多的酸性物质[12]。在适宜的温度条件和茶坯含水量条件下，发酵茶香型向酯香型转变[13]，表明此时发酵茶中具有酯类物质的产生，这可能是由于外界环境的诱导，使得微生物的代谢过程发生变化，从而产生有利于发酵茶品质的物质。

3.2 不同条件对荔枝产香菌发酵茶理化品质的影响

在不同条件下，荔枝产香菌发酵茶理化成分发生复杂变化。本试验中主要测定了发酵茶中水浸出物、游离氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量。微生物在生长过程中需要利用一定的氮源和碳源物质来维持自身生长[14-15]，因此茶叶中可溶性糖和游离氨基酸被微生物优先消耗[16]。微生物在生长的同时会分泌多种酶类，如纤维素酶、果胶酶、脂肪酶和单宁酶等[17-20]，在酶的作用下，茶叶中的不溶性大分子物质会转化为可溶性物质，增加可溶性物质的含量，同样生成多种促进茶叶品质形成的物质，因此发酵茶的水浸出物、游离氨基酸和可溶性糖含量可能由于微生物生长消耗与酶水解不溶性物质而呈现动态变化。茶多酚是一类极易被氧化的物质，除了在酶的作用下分解外，发酵过程自然氧化也会导致其含量的降低[21]，因此茶多酚含量在发酵过程中显著降低。目前对茶叶发酵代谢组的研究层面相对较浅，并没有很好地解释发酵过程中物质的详细变化过程。

图4 不同发酵时间的荔枝产香菌茶理化成分Fig.4 Chemical components of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation time

3.3 荔枝产香菌发酵茶的推广价值

纵观安化黑茶的发展历史，其发展推动力逐渐由政府或市场主导转变为市场和技术创新共同主导，技术创新已成为安化黑茶发展的重要战略之一[22]。微生物在黑茶品质形成中占有的重要地位已得到公认，对普洱茶、茯砖茶、六堡茶和四川黑茶渥堆发酵过程中微生物的研究正持续进行中，特别是普洱茶中微生物的研究层面和研究手段已相对较多[23-27]。笔者用于黑茶发酵的微生物，已经不能仅仅局限于从渥堆茶叶中分离获得，其他来源的优质菌株的利用同样具有良好的发展前景[28]。荔枝产香菌发酵茶的运用不仅提高茶叶原料的品质，而且对黑茶清洁化生产和开发黑茶新产品具有重要意义。因此，荔枝产香菌发酵荣具有一定的推广价值。