紫铆花素抑制脂多糖诱导的骨髓源性巨噬细胞炎症反应的研究

陈子卓，徐宇航，#，姜晓旭，赵九洲，朱敬朴，郑义鹏，吴浩芝，李文丽，王 欣，*，海春旭，*，于卫华，*

(1．空军军医大学基础医学院，陕西 西安710032；2．空军军医大学第一附属医院综合诊疗科，陕西 西安 710032；3．空军军医大学军事预防医学院军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032)

紫铆花素(butein)是一种由植物中分离提取的多酚类单体化合物，是传统中草药锦鸡儿和降香的主要活性成分[1]。研究发现，紫铆花素具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗纤维化和抗肿瘤等生物学效应，具有良好的药物开发价值和前景[2]。脂多糖(lipo poly saccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的重要活性成分，可与巨噬细胞膜上Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)结合，诱导巨噬细胞炎症反应的发生。Janus激酶(Janus kinases，JAKs)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，可在细胞因子作用下发生磷酸化，并通过信号转导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)启动下游靶基因，发挥生物调控作用。STAT3是STATs家族的成员，可在胞浆内与多种细胞因子受体结合，进而转移至核内发挥转录调控作用[3]。大量研究表明，JAK2-STAT3活化与细胞增殖、分化和免疫调节密切相关，在炎症和肿瘤进展中发挥关键作用[4]。敲减JAK2和STAT3可阻断多种炎症因子诱导的巨噬细胞活化[5]。而在小鼠脓毒血症模型中，使用JAK2-STAT3通路抑制剂，可有效阻断核转录因子NFκB激活，提高小鼠的生存率[6]。最新研究发现，紫铆花素是一种特殊的蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，可显著阻断表皮生长因子受体磷酸化[7-8]。那么，JAK2作为一种酪氨酸蛋白激酶，是否受到紫铆花素调控，目前并不清楚。因此，本研究旨在探讨butein是否对LPS诱导炎症具有抑制作用，及JAK2-STAT3通路在其中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和试剂 C57BL/6小鼠由第四军医大学动物中心提供；紫铆花素标准品购自中国药品生物制品中心，纯度98%；LPS购自Sigma公司；H2DCFH-DA荧光探针购自Invitrogen公司；小鼠TNF-α、IL-6和NO酶联免疫试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和βactin抗体均购自Birobyt生物公司；RMPI 1640培养液、胎牛血清、红细胞裂解液、PBS均购自上海吉诺医药生物技术公司。

1.1.2 仪器 垂直流超净工作台购自ESCO公司，型号SCV-4A1；CO2培养箱为Thermo公司的3111/371型号；全波段酶标仪购自infinite公司，型号M200 PRO；流式细胞仪购自BD公司，型号Accuri C6；倒置显微镜购自Olympus公司，型号IX73；电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性巨噬细胞的分离培养 取8周龄小鼠胫骨和股骨，无菌环境中RMPI 1640培养基冲洗骨髓细胞。裂解红细胞后，用40 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激7 d，分化为骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)，通过贴壁筛选，获得纯化BMDM。采用含10%胎牛血清(FBS)的RMPI 1640培养基，置于CO2体积分数为5%的37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞处理以及实验分组 BMDM采用500 ng/mL的LPS刺激12 h建立炎症模型，受试物干预组使用5、10、20μmol/L的butein与LPS共处理，阴性对照组为20μmol/L的butein单独处理12 h，并设立空白对照组，每组3个重复。

1.2.3 细胞培养基中TNF-α、IL-6和NO含量检测采用ELISA法检测培养基中TNF-α，IL-6和NO含量。细胞处理完成后，收集培养基，2 000 r/min离心10 min去除细胞。按照试剂盒说明书加入待测样品和标准品，37℃环境下孵育2 h。清洗后加入检测工作液，孵育30 min，酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，并根据标准品吸光度曲线推算样品中TNF-α和IL-6含量。

1.2.4 细胞ROS水平检测 DCFH-DA是细胞内ROS测定的特异性荧光探针。DCFH-DA进入细胞后，可被水解为无荧光的DCFH，进而被ROS氧化为有荧光的DCF。DCF荧光越强，表明细胞内ROS水平越高。处理完成后，细胞中加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，37℃环境下孵育30 min，流式细胞仪检测荧光强度。

1.2.5 Western blot测定细胞内蛋白表达 细胞处理完成后，RIPA裂解液裂解细胞。BCA法进行蛋白定量，每组上样20μg。选用10%凝胶，90 V电压15 min，然后150 V电压电泳约1 h结束。25 V、30 min条件下将凝胶蛋白转至NC膜。5%BSA，37℃条件下封闭40 min。加入按要求稀释的iNOS、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3和β-actin一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶5 000稀释的二抗，37℃孵育60 min。TBST洗膜4次，每次15 min。凝胶成像系统拍照。采用Quantity One软件分析蛋白表达变化，并以对照组为基准进行标准化。计算p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白条带灰度比值变化，并以对照组为基准进行标准化。

1.3 统计学方法

实验数据以平均数±标准差表示，采用方差分析检测组间方差是否齐性。两组之间差异采用LSD t检验作比较，P＜0.05表示组间差异有统计学意义，数据统计分析采用SPSS 13.0软件。

2 结果

2.1 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞促炎因子分泌

巨噬细胞在LPS等刺激下，可释放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等。ELISA检测BMDM培养液中促炎因子浓度的结果见图1A和图1B。我们使用500 ng/mL的LPS刺激BMDM 12 h，ELISA法测定细胞上清中TNF-α和IL-6含量。结果发现，LPS刺激后BMDM培养基中TNF-α和IL-6浓度显著升高(P＜0.05)。而5、10和20μmol/L的butein共处理后BMDM培养基中TNF-α和IL-6浓度明显降低。其中，20 μmol/L的butein对TNF-α分泌的抑制率为68.6%，对IL-6分泌的抑制率为84%。

A：TNF-α浓度；B：IL-6浓度.n=3.与空白对照组比较，*P＜0.05；与LPS单独处理组比较，#P＜0.05.图1 ELISA法检测小鼠骨髓源性巨噬细胞培养液中的促炎因子浓度

2.2 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞NO合成

NO在机体炎症和免疫调节中发挥关键作用。在炎症因子刺激作用下，巨噬细胞激活并释放大量NO，具有杀菌和杀伤肿瘤细胞的作用。ELISA检测BMDM培养液中NO浓度的结果见图2A。LPS刺激下BMDM培养基中NO浓度显著升高，而5、10和20 μmol/L的butein共处理显著降低NO的合成(P＜0.05)。iNOS是巨噬细胞内调控NO合成的关键酶，iNOS表达和活性水平决定细胞NO的合成能力。Western blot检测BMDM中iNOS表达水平的结果见图2B，LPS活化BMDM的iNOS蛋白表达增加，而给予butein干预显著降低iNOS表达(P＜0.05)。

2.3 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞ROS生成

在感染和炎症条件下，巨噬细胞会释放大量ROS，用于杀灭入侵病原菌。因此，ROS生成增多是M1型活化巨噬细胞的重要特征。DCFH-DA染色后流式细胞术检测ROS生成的结果见图3。LPS刺激下BMDM内DCF信号增强约30倍(P＜0.05)，表明LPS诱导BMDM生成ROS。而使用5、10和20μmol/L的butein共处理，DCF荧光曲线明显左移(P＜0.05)，表明butein抑制了LPS诱导的ROS生成。

2.4 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞JAK2激活

A：ELISA法检测细胞培养基中NO浓度；B：Western blot检测细胞内iNOS蛋白表达.n=3.与空白对照组比较，*P＜0.05；与LPS单独处理组比较，#P＜0.05.图2 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞NO合成

A：流式细胞术检测细胞培养基中DCFH-DA荧光强度；B：DCF平均荧光强度统计.n=3.与空白对照组比较，*P＜0.05；与LPS单独处理组比较，#P＜0.05.图3 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞ROS生成

JAK2是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，可在众多细胞因子作用下激活，并通过STAT3启动下游靶基因。Western blot检测p-JAK2与JAK2表达水平的结果见图4。LPS刺激下BMDM中JAK2蛋白表达无明显变化，但p-JAK2表达增多，且p-JAK2与JAK2蛋白条带灰度比值显著升高(P＜0.05)。研究表明，紫铆花素是一种酪氨酸激酶抑制剂。我们发现，与LPS组相比，butein共处理组p-JAK2表达降低，且p-JAK2/JAK2比值减少，以20μmol/L组最为明显(P＜0.05)。

A：Western blot检测细胞内p-JAK2和JAK2蛋白表达；B：p-JAK2/JAK2比值的统计分析.n=3.与空白对照组比较，*P＜0.05；与LPS单独处理组比较，#P＜0.05.图4 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞JAK2激活

2.5 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞STAT3激活

STAT3是细胞浆内重要的信号转导和转录调节因子，在细胞因子刺激下STAT3磷酸化并转位至细胞核，启动下游靶基因转录。Western blot检测内p-STAT3和STAT3表达水平的结果见图5。LPS刺激下BMDM中p-STAT3表达增多，且p-STAT3与STAT3蛋白条带灰度比值显著升高(P＜0.05)。与LPS单独处理组相比，butein共处理后BMDM内p-STAT3表达降低，且p-STAT3/STAT3比值减少，以20μmol/L组最为明显(P＜0.05)。

A：Western blot检测细胞内p-STAT3和STAT3蛋白表达；B：p-STAT3/STAT3比值的统计分析.n=3.与空白对照组比较，*P＜0.05；与LPS单独处理组比较，#P＜0.05.图5 紫铆花素抑制LPS诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞STAT3激活

3 讨论

炎症与健康息息相关，一方面发挥免疫杀伤作用，可清除病原菌和恶性转化细胞，另一方面通过损伤机体导致多种急慢性疾病。研究表明，90%以上临床疾病均存在炎症细胞的浸润和炎症反应的发生，例如感染、脓毒血症、肥胖和肿瘤等[9-10]。巨噬细胞是体内最主要的炎症效应细胞，广泛存在于诸多组织和器官内。在脂多糖等致炎因子刺激作用下，巨噬细胞发生M1型极化。本研究通过分离小鼠骨髓，并使用GM-CSF诱导分化为BMDM[11]。在500 ng/mL的LPS刺激下，BMDM激活，并释放一系列炎症因子，包括TNF-α、IL-6和NO等。同时氧化应激与炎症关系密切，巨噬细胞在炎症因子刺激下可释放大量ROS，而ROS可通过NFκB和COX2调控炎症反应。我们在本研究中发现，LPS刺激下BMDM内炎性因子和ROS水平显著升高，结果表明成功建立了LPS刺激BMDM的体外炎症模型。

紫铆花素是一种由中药中提取的多酚类单体化合物，具有多种生物学活性[12]。大量研究表明，紫铆花素具有抗菌、抗肿瘤、神经保护和心血管保护功能[13-14]。而有关紫铆花素与炎症相关研究较少，本研究中我们使用5、10和20μmol/L紫铆花素与LPS共同处理BMDM 12 h。结果发现紫铆花素可抑制LPS诱导的BMDM炎症反应并呈剂量-效应关系，降低培养基中TNF-α、IL-6和NO含量。其中NO既是一种重要炎症介质，又是一种活性较强的ROS，在体内具有重要生物学作用[15]。而NO合成依赖于iNOS，紫铆花素抑制了iNOS的表达，进而降低了培养基中NO含量。此外，DCFH-DA染色结果也证实，紫铆花素抑制了LPS诱导的巨噬细胞ROS生成。近年来研究表明，炎症反应与氧化应激既存在交互作用，又存在独立作用，因此单纯抗炎或者抗氧化往往不足以根除炎症[16]。因此，我们研究认为紫铆花素兼具抗炎和抗氧化作用，是一种具有研究和开发价值的抗炎药物。

JAK-STAT是细胞内重要的信号传导和转录通路，可以通过与多种细胞因子和生长因子结合，参与机体细胞的增殖、分化、凋亡和免疫调节功能[17]。细胞因子与JAK受体结合后形成二聚体，并促进JAK的酪氨酸的磷酸化，活化的JAK可与STAT结合，引起STAT磷酸化以及核转位，进而启动下游靶基因转录[18]。近年来研究发现，JAK-STAT信号通路与巨噬细胞激活和炎症反应密切相关[5]。敲减或抑制JAK2可显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞TNF-α和IL-6表达。而JAK2可通过活化STAT3诱导巨噬细胞HMGB1和IL-6的转录表达，使用JAK2-STAT3通路抑制剂，可降低上述促炎因子的表达[19]。我们发现LPS刺激下BMDM中JAK2和STAT3的磷酸化显著升高，表明该通路激活。紫铆花素被认为是一种酪氨酸激酶抑制剂，而JAK2作为一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，紫铆花素是否通过JAK2影响STAT3转录活性目前并不清楚。本研究表明紫铆花素可显著阻断LPS活化BMDM的JAK2和STAT3的磷酸化。因此，我们认为紫铆花素可能是通过JAK2-STAT3信号通路发挥抗炎效应。

综上所述，紫铆花素可显著抑制LPS诱导的BMDM活化，降低炎症因子和ROS生成。作为一种酪氨酸激酶抑制剂，紫铆花素可能通过抑制JAK2-STAT3发挥抗炎效应。本研究证实紫铆花素是一种新的抗炎候选药物，为炎症相关疾病防治提供了新的策略。