p-m TOR蛋白在结直肠癌组织中的表达及患者预后判断中的价值

朱依青，张彤彤，2，郑珺文，郝佳洁，蔡 岩，王明荣，梁建伟*，张 钰，*

(1．国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021；2．成都市第三人民医院实验医学研究部，四川 成都610031；3．国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，结直肠外科，北京 100021)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤。在世界范围内，结直肠癌的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第3和第4位[1-2]。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第5位[3]，而且近年来我国结直肠癌的发病率呈现不断上升趋势。复发和转移是结直肠癌患者死亡的主要原因[4-6]，然而依据现有的临床病理指标尚不能准确预测结直肠癌患者的预后，因此迫切需要寻找有效的生物标志物，对患者术后复发及死亡风险进行更为准确地鉴别及分层。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian/mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PI3K相关激酶超家族成员。mTOR是两个不同的蛋白复合物，即mTOR复合物1和2(mTORC1和mTORC2)的催化中心。mTOR复合物通过磷酸化底物调节多种生物学过程，包括细胞生长、增殖、存活和细胞骨架组织等[7-9]。有报道显示mTOR信号通路在多种恶性肿瘤中表达失调并与患者的预后不良相关[10-12]。然而，迄今为止结直肠癌中mTOR异常活化与患者预后的关系尚不明确。

在本研究中，我们采用组织芯片-免疫组织化学染色技术检测p-mTOR(Ser2448，活性形式的mTOR)蛋白在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达情况，探讨pmTOR蛋白表达改变与结直肠癌临床病理指标及患者预后的关系。

1 材料和方法

1.1 病例和标本

441例结直肠癌组织以及同一患者手术切端形态学正常的结直肠组织，取自于中国医学科学院肿瘤医院(2007年1月—2011年12月)，均为临床诊断后剩余的、无坏死的新鲜组织，常规使用福尔马林固定和石蜡包埋。所有患者均签署了知情同意书，该项研究的设计和进行获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准(NCC2016JZ-06)。

以组织病理学检查为确诊标准，并根据AJCC第八版结直肠癌分期系统对确认病例进行TNM分期。患者平均年龄57.3岁，中位年龄59.0岁(14～91岁)。其中，187名患者(42%)接受了辅助化疗和/或放化疗，辅助化疗采用5-氟尿嘧啶为基础的化疗方案。无病生存率和总生存率为主要的研究终点。无病生存率定义为手术后一段时间内发生复发或转移等疾病症状和体征的个体的百分比，总生存率定义为手术后一段时间内死亡个体的百分比。随访至少5年，97%(429/441)的患者有完整的随访信息，其中34%(148/441)的患者在随访期间出现肿瘤复发或转移。

1.2 组织芯片-免疫组织化学染色检测

每个病例选取3个典型的癌组织点和2个相邻癌旁正常组织点，本室制作结直肠癌组织微阵列(TMAs)并制备4μm切片[13]。使用PV9000免疫组化试剂盒和DAB染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)进行免疫组化检测，按试剂盒说明进行操作。主要步骤如下：切片脱蜡至水化，3%的H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性，微波抗原修复，p-mTOR抗体孵育4℃过夜，DAB显色，苏木素复染、脱水、封片。p-mTOR一抗(Ser2448，#2976)购自CST公司，免疫组化实验稀释比为1∶100。将已知p-mTOR高表达的恶性肿瘤细胞的组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断

免疫组化反应出现棕黄色颗粒判断为阳性，根据染色强度和染色面积百分比量化蛋白相对表达水平[14-15]。其中，着色程度的评分标准为：无染色0分，弱染色1分，中染色2分，强染色3分；染色面积的评分标准为：着色范围≤10%为0分，＞10%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。最终的评分是两者得分之积。若两者得分之积≥3分则为高表达，＜3分则为低表达。

1.4 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0进行统计学分析。采用配对t检验用于评估结直肠癌与邻近正常组织的蛋白表达差异。采用Pearson卡方检验和Fisher精确检验分析p-mTOR的表达水平与临床病理参数之间的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检测分析p-mTOR高表达与患者无病生存率和总生存率的关系，使用Cox比例风险模型确定独立预后因素。

2 结果

2.1 p-mTOR在结直肠癌组织中高表达

使用含有441例结直肠癌组织和手术切端形态学正常的结直肠上皮的组织芯片，进行p-mTOR蛋白表达水平的免疫组织化学检测，结果显示p-mTOR主要定位于细胞膜和细胞质(图1A)，其在结直肠癌组织中的阳性表达率为58%(254/441)，而在正常结直肠上皮中的阳性表达率仅为4%(17/441)，两者之间表达水平差异显著(P＜0.01，图1B)。

A：p-mTOR蛋白的免疫组织化学染色结果；B：441例结直肠癌及邻近正常结肠上皮中p-mTOR蛋白表达水平的比较.图1 免疫组织化学法检测结直肠癌组织中p-mTOR蛋白的表达

2.2 p-mTOR表达水平与结直肠癌临床病理指标的关系

我们检测了结直肠癌组织中p-mTOR的表达与临床病理指标的关系，统计分析结果显示，与未发生淋巴结转移(N0)以及远处转移(M0)的结直肠癌患者相比，出现淋巴结转移(N1/2)以及远处转移(M1/2)的患者组织中p-mTOR的表达水平更高。同时，T3/4期患者以及Ⅲ/Ⅳ分期患者的肿瘤组织中p-mTOR的表达水平高于T1/2期及Ⅰ/Ⅱ期患者(P均＜0.05)，而p-mTOR的表达水平与患者年龄、性别及组织学分级等指标间的差异无统计学意义(表1)。

2.3 p-mTOR表达水平与结直肠癌患者预后的关系

分析p-mTOR高表达对结直肠癌患者临床预后的影响，结果显示441例结直肠癌患者术后5年无病生存率和总生存率分别为65%和63%，无病生存时间和总生存时间分别为61和63个月。p-mTOR高表达患者的无病生存期和总生存期分别为52和60个月，明显短于p-mTOR低表达患者的71和70个月，差异具有统计学意义(P均＜0.01，图2)。以上结果提示，通过检测p-mTOR的表达水平，可以预测结直肠癌患者的预后。

2.4 p-mTOR高表达是影响结直肠癌患者无病生存率和总生存率的独立预后因素

p-mTOR表达水平和相关临床病理特征与结直肠癌患者预后的关系见表2和表3。单因素分析和Cox多因素回归分析结果显示pT、组织学分级及p-mTOR表达水平是结直肠癌患者术后无病生存率和总生存率的独立预后因素(P均＜0.01)。此外，辅助治疗是结直肠癌患者总生存率的独立预后因素(P=0.039)。

表1 结直肠癌组织中p-mTOR蛋白表达与临床病理指标的关系

A：无病生存率；B：总生存率.根据结直肠癌组织中p-mTOR蛋白的免疫组化染色结果绘制Kaplan-Meier生存曲线，P值为Log-rank检验结果.HR：风险比；CI：置信区间.图2 p-mTOR蛋白表达与结直肠癌患者5年无病生存率与总生存率的关系

表2 结直肠癌根治术患者术后无病生存率与总生存率的单因素Cox回归分析

表3 结直肠癌根治术患者术后无病生存率与总生存率的多因素Cox回归分析

3 讨论

复发转移是结直肠癌治疗失败及患者死亡的主要原因。准确判断患者术后的复发转移风险可帮助临床医生为患者制定更合理、更有针对性的随访及治疗方案，有助于实现个体化的精准治疗。因此，寻找、鉴定可准确识别高危结直肠癌患者的生物标志物在改善患者预后及提高其生存率方面具有重要意义及应用价值。

在本研究中，我们发现p-mTOR的表达水平在58%的结直肠癌病例中异常升高，其表达水平与结直肠癌患者的无病生存率和总生存率显著相关，并且是独立的不良预后因素。与我们的发现相似，近期有研究报道p-mTOR在74%的结直肠癌病例中高表达，并且是独立的不良预后指标[10]。相反，早期的一项研究结果显示，p-mTOR的表达水平与结直肠癌患者的预后无关[16]。因此，今后可能需要进行更多的研究以阐明mTOR异常活化与结直肠癌预后的关系。

由于mTOR信号转导在肿瘤细胞生物学中起着极为重要的作用，它一直被认为是一个非常具有临床应用前景的治疗靶点，目前已有多种靶向抑制剂在进行恶性肿瘤治疗的临床试验[17-19]。同时，以往有研究表明，mTOR通路的过度活化可促进结直肠癌的发生和发展[20-23]。我们的免疫染色结果显示，在近60%的结直肠癌病例中存在mTOR的异常活化并与患者较高的复发和死亡风险密切相关。上述发现提示mTOR不仅可作为结直肠癌患者预后分层的分子标志，同时也可作为高危患者靶向治疗的候选分子靶点。

综上所述，本研究发现mTOR在结直肠癌组织中异常活化，p-mTOR的阳性表达与患者的不良预后密切相关并且是独立的预后因素，提示mTOR的异常活化不仅可用于鉴别具有较高复发转移风险的结直肠癌患者，而且可能成为这些高危患者治疗的潜在分子靶点。

(感谢国家癌症中心/国家肿瘤临床研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院的赵传多医生在病例随访工作中给予的帮助)