斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

孙 杨,陈 琼,2,胡妍月,秦文婧,黄水金*

(1.江西省农业科学院 植物保护研究所,江西 南昌 330200;2.江西省自然资源厅 国土资源勘测规划院,江西 南昌 330025;3.江西省农业科学院 土壤肥料与资源环境研究所,江西 南昌 330200)

0 引言

精氨酸激酶(arginine kinase, AK),是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶。它通过催化精氨酸与ATP之间的可逆反应,将能量储存于磷酸精氨酸的高能磷酸键中,或将磷酸精氨酸分解产生ATP,从而对无脊椎动物体内的能量代谢、储存和利用起关键的调节作用。有研究表明,精氨酸激酶不仅在肌肉中大量存在,也存在于能量需求较大的脑、触角和复眼中[1],并且在沙漠蝗(Schistocercagregaria)的后肠[2]及烟草天蛾(Manducasexta)的中肠里也发现了高活性的精氨酸激酶参与上皮细胞中的离子运输[3]。此外精氨酸激酶能与肌动蛋白结合,与动物的运动存在密切关系[4]。迄今,已有甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)等10多种昆虫的精氨酸激酶基因被克隆。

斜纹夜蛾[Spodopteralitura(Fab.)]是一种世界性分布的重要农业害虫。它的寄主植物已知有109科389种,尤以棉花、烟草、大豆、玉米和甘蓝等作物受害最重[5-6]。近年来,由于化学农药的大量使用,斜纹夜蛾对多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性[7-9]。多数常规药剂对斜纹夜蛾的防治效果显著下降,已不能有效控制其为害[10]。为此,本研究在克隆斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的基础上,对其分子特征及组织和发育时期的表达特性进行了分析,以期为农业生产中寻找合理的害虫防治方法提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

斜纹夜蛾卵块由南京农业大学昆虫生理与分子生物学实验室友情赠送,卵块孵化后幼虫用人工饲料饲养；饲养温度为26 ℃,光周期为16L∶8D。在蛹期分雌雄分别饲养,待羽化后将雌雄配对放入养虫笼内,养虫笼内四壁贴有白纸,上盖纱布,以供成虫产卵。在笼内喂以10%蜂蜜水。

1.2 试剂和试剂盒

总RNA提取试剂UNIQ-10购自上海生工；反转录Quantscript RT Kit Quant cDNA购自天根生物科技有限公司； Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD-18T载体、3′RACE Kit、SYBP Premix EX TaqTM(Perfect Real Time)等购自大连宝生物工程有限公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自BBI。

1.3 斜纹夜蛾AK基因全长cDNA的克隆

1.3.1 总RNA提取和第一链cDNA的合成 取3龄斜纹夜蛾幼虫的中肠,用液氮研磨后采用Trizol法提取总RNA,并反转为第一链cDNA。

1.3.2 AK基因片段的克隆 参考GenBank中已登录的甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GenBank:GQ379235)、烟芽夜蛾Heliothisvirescens(GenBank:GU726905)的AK基因序列,设计简并引物SlAKF1和SlAKR1(表1)。以第一链cDNA为模版进行扩增,反应参数为:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,PCR产物经纯化试剂盒纯化后连接到pMD-18T载体中,转化DH5α感受态细胞；挑取阳性克隆经酶切鉴定后进行测序分析,测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.3.3 3′RACE扩增 采用Trizol法提取总RNA,用DNaseⅠ消化痕量DNA,根据试剂盒说明书合成SMART cDNA模版,设计合成基因特异性引物SlAKF2和SlAKF3，与试剂盒中的3′下游引物进行巢式PCR。反应参数为:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共25个循环;最后72 ℃延伸10 min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收PCR产物。纯化、克隆扩增产物，然后进行序列测定，具体步骤见1.3.2。

1.3.4 序列分析与系统进化树的构建 序列分析采用生物信息学在线工具(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)；Blast相似性搜索在NCBI网站进行,用Clustal W和GeneDoc软件进行多序列比对；利用MAGE 4.0软件中的邻接法构建系统进化树。

1.4 斜纹夜蛾AK基因表达的定量分析

1.4.1 斜纹夜蛾AK基因在幼虫不同组织中的表达 分别取进入5龄第二天幼虫的头部、中肠、表皮和脂肪体,提取总RNA,反转录后进行实时荧光定量PCR反应(以Actin基因为内参)。PCR扩增条件为:94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。重复3次。

1.4.2 斜纹夜蛾AK基因在幼虫不同发育时期的表达 分别取进入1龄、2龄、3龄、4龄、5龄、6龄蜕皮第二天的斜纹夜蛾幼虫,提取总RNA,反转录后进行实时荧光定量PCR反应,方法同1.4.1,重复3次。

1.4.3 数据统计处理 采用2-△△CT方法进行实验数据的统计处理,△CT=CT目的基因-CT内参基因;△△CT=△CT试验组-△CT对照组[11]。根据所得数据作柱状图,并计算标准误。

表1 引物设计

2 结果与分析

2.1 斜纹夜蛾AK基因的克隆

利用简并引物SlAKF1/SlAKR1通过PCR扩增AK基因的目的片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带(图1A),其长度为1345 bp。经BLAST分析,此序列与甜菜夜蛾等昆虫精氨酸激酶基因的同源性达96%。因此将该基因命名为斜纹夜蛾精氨酸激酶基因SlAK。进而通过RACE技术获得了326 bp的3′端序列(图1B)。最后经拼接获得了斜纹夜蛾AK基因的全长cDNA序列(图2, GenBank登录号为HQ840714)。如图2所示,该基因全长为1373 bp,5′和3′UTR的长度分别为65和240 bp,在3′UTR区有1个加尾信号AATAA以及18 bp的poly(A)尾巴；其开放阅读框位于66～1133 bp,编码355个氨基酸。位于SlAK氨基酸序列中的高度保守的7个氨基酸CPTNLGT(270～276)是精氨酸激酶的活性中心部位序列,其中第270位的半胱氨酸(C)是AK所必需的酶活性位点；第61位的天冬氨酸(Asp)与第192位的精氨酸(Arg)可以形成离子耦合结构,该离子耦合结构对精氨酸激酶的活性具有重要作用。

M1:DNA分子量标准DNA marker DL2000; 1:部分序列PCR产物; M2:DNA分子量标准DNA marker DL1000; 2:3′RACE产物。

图中方框示酶活性中心氨基酸序列；双下划线示加尾信号。

2.2 斜纹夜蛾与其它昆虫AK序列的比对

AK的氨基酸序列高度保守。由图3可见,斜纹夜蛾SlAK与其他昆虫AK的氨基酸序列的同源性达80%以上,与近缘种烟芽夜蛾的同源性高达99%(350/355 aa),与甜菜夜蛾的同源性为98%(348/355 aa)。

SaAK:美洲沙漠蝗Schistocercaamericana(U77580); LmmAK:东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis(DQ513322); PaAK:美洲大蠊Periplanetaamericana(GU301882); HvAK:烟芽夜蛾Heliothisvirescens(GU726905); HaAK:棉铃虫Helicoverpaarmigera(GU396008); SlAK:斜纹夜蛾Spodopteralitura(HQ840714); SeAK:甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GQ379235); PiAK:印度谷螟Plodiainterpunctella(AJ315030); PxAK:小菜蛾Plutellaxylostella(HQ327310); BmAK:家蚕Bombyxmori(FJ013046); PsAK:黄曲条跳甲Phyllotretastriolata(EU420057); DmAK:黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(NM_168313)。

图3 斜纹夜蛾AK与其他昆虫AK氨基酸序列的比对

将斜纹夜蛾AK氨基酸序列与部分已知的其他昆虫AK氨基酸序列进行比对后构建进化树,结果如图4所示。鳞翅目昆虫AK共聚一支,其中斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的AK亲缘关系最近,并与烟芽夜蛾及棉铃虫位于同一分支上,这与它们在分类地位上的亲缘关系远近是一致的。

2.3 斜纹夜蛾AK基因在幼虫不同组织内的表达

SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同组织内的表达结果如图5所示。在头部、中肠、体壁、脂肪体中均有表达。以体壁CT中的表达量为1,中肠表达量约为33.8倍,表达量最高;其次是头部与脂肪体,表达量分别为10.9倍和13.8倍。

所用氨基酸序列与图3相同。

HD:头; MD:中肠; FB:脂肪体; CT:体壁。

2.4 斜纹夜蛾AK基因在幼虫不同发育时期的表达

SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育时期中肠内的相对表达水平如图6所示。SlAK在幼虫2龄的表达量最低；以在幼虫2龄的表达量为参照(设为1)，在幼虫3龄时期的SlAK表达量达到最高，为33.4倍，这可能与3龄期幼虫的能量代谢旺盛有关；在其余各龄期的表达量最高不超过5倍。

图6 SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育时期的相对表达水平

3 小结与讨论

精氨酸激酶(AK)广泛存在于无脊椎动物中,为生命活动提供能量,并维持体内ATP的平衡。本研究采用RT-PCR和RACE技术获得了斜纹夜蛾1373 bp的SlAK基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR技术测定了精氨酸激酶基因在斜纹夜蛾幼虫不同组织和不同发育阶段的表达情况。结果表明精氨酸激酶基因为组成型表达,在斜纹夜蛾幼虫的中肠内相对表达量最高,其次是在脂肪体内的表达量,而在体壁内的表达量最低。这与精氨酸激酶基因在烟夜蛾(Helicoverpaassulta)[12]、烟草天蛾[5]中肠中的高表达一致。此外,王华兵等发现AK在家蚕脂肪体中的表达量较高[13]；而在凡纳滨对虾表皮中的AK表达量最低[14]。这些结果表明精氨酸激酶基因的表达量与组织细胞的代谢活性密切相关。

精氨酸激酶基因在昆虫不同发育时期有不同表达。王华兵等研究发现家蚕精氨酸激酶基因在幼虫期的表达量随龄期增长而逐渐增加，且均高于蛹期[13]；张元臣等(2011)对烟夜蛾幼虫4、5龄期及蛹期脂肪体的精氨酸激酶基因的表达量进行了研究，发现在预蛹期的表达量达最高峰,其次为4龄,而在5龄的表达量一直处于较低水平[12]。本研究仅对斜纹夜蛾幼虫不同发育时期的精氨酸激酶基因的表达量进行了检测,发现在3龄幼虫期的表达量达最高峰,这可能与斜纹夜蛾3龄幼虫从聚集取食转向分散取食而需要的能量加剧有关,具体原因待进一步探明。

精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物中,该酶及其磷酸原的能量代谢途径与哺乳动物中的完全不同[15-17],因此精氨酸激酶可以作为控制昆虫的一个很好的靶标,高效无毒且环境友好[18]。一些精氨酸激酶抑制剂先后被用于对酶活性和对害虫的影响研究[19--20]。Zhao等研究发现,给黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)成虫喂食精氨酸激酶基因dsRNA能导致黄曲条跳甲生育力下降和死亡[18]。因此,精氨酸激酶基因作为新的害虫控制靶标,有助于发展新的害虫控制药剂,在害虫防治中发挥重要作用;而基于精氨酸激酶基因的RNA干扰技术是否可用于斜纹夜蛾的防治值得进一步的研究。