基于网络药理学研究补中益气汤治疗糖尿病肾病的潜在作用机制

陈璟 徐坠成 徐贝贝 许惠琴 吕志阳

摘 要：目的：运用网络药理学技术预测补中益气汤治疗糖尿病肾病的作用靶点和信号通路，进一步探讨补中益气汤防治糖尿病肾病的物质基础和潜在作用机制。方法：利用中药系统药理学技术平台（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获得补中益气汤的活性成分及其作用靶点，从GeneCards数据库收集与糖尿病肾病相关的靶标基因，将药物作用靶点和疾病相关靶标基因取交集得到该方治疗糖尿病肾病的关键作用靶点，使用String数据库对关键作用靶点构建蛋白质相互作用网络，并通过Cytoscape软件将结果可视化。借助DAVID和ClueGo对关键作用靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和KEGG富集。结果：该方法找出了补中益气汤182个活性成分和41个关键作用靶点其中DPP4，MAPK14，MAPK3，MAPK8，MMP2，MMP3，MPO，MTTP，NOS3等关键基因主要通过调控AGE-RAGE信号通路，Toll样受体信号通路，cAMP信号通路，白细胞介素17（IL-17）信号通路，Relaxin信号通路，在细胞外泌体，细胞间隙，细胞核中发挥作用。结论：通过网络药理学预测补中益气汤防治糖尿病肾病的关键靶点及其相关信号通路，推测该方剂对糖尿病肾病的潜在作用机制，可能主要参与抗炎、调节糖脂代谢及氧化应激等过程，为阐明补中益气汤对糖尿病肾病的作用机制提供了科学依据。

关键词：补中益气汤;糖尿病肾病;网络药理学

中图分类号：R285.5  文献标识码：A

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病较为常见的微血管并发症之一，是终末期肾病的主要原因。中药复方在治疗糖尿病及其并发症具有很大的潜力，并在临床上也取得了很好的效果。補中益气汤为中医临床常用经典方剂之一，记载于《内外伤辨惑论》，具有多年的临床使用经验，对防治糖尿病及其并发症起到了很好的临床疗效。

网络药理学是中药药理的研究从“单个成分-单个靶点-单个疾病”向“多基因-多靶点-复杂疾病”的模式转变。本研究采用网络药理学的方法，通过相关数据库对补中益气汤所含的活性成分进行筛选，并与疾病基因关联得到关键作用靶点，对关键作用靶点进行生物信息学分析以求更为系统的了解补中益气汤治疗糖尿病肾病的机制，为进一步实验验证打下基础。

1 材料及方法

1.1 活性成分作用靶点的获取及收集

使用TCMSP平台筛选出口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的活性成分。通过TCMSP寻找活性成分的作用靶点，使用uniprot将活性成分的作用靶点的名称导入，找出其与人类相关的基因并进行整理，得到活性成分作用靶点。利用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”关系网络。

1.2 糖尿病肾病疾病靶点的获取及收集

GeneCards数据库基本覆盖了几大数据库对于基因的分析数据，是人类基因的综合数据库。GeneCards数据库提供简明的基因组，蛋白质组，转录，遗传和功能上所有已知和预测的人类基因。使用GeneCards数据库获取与糖尿病肾病相关靶点基因。

1.3 关键靶点的获取

将药物活性成分作用靶点和疾病靶点基因取交集，获得补中益气汤治疗糖尿病肾病的关键靶点。

1.4 关键靶点蛋白相关作用网络的构建

String数据库（https：//string-db.org/Version11.0）是用于预测的蛋白质-蛋白质相互作用的生物学数据库，其数据来自众多来源的信息，包括实验数据，计算预测方法和公共文本集，可用于检索蛋白/基因相互作用。将补中益气汤处方治疗糖尿病肾病的关键靶点导入String数据库，将研究物种为选择为人类，获得蛋白互作关系，将结果以TSV格式导出。将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，绘制蛋白相互作用网络。节点大小与Degree值大小成正比。

1.5 关键靶点生物功能注释及通路分析及可视化

DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）的网址是http：//david.abcc.ncifcrf.gov/。DAVID是一个生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表（成百上千个基因ID或者蛋白ID列表）提供系统综合的生物功能注释信息，帮助用户从中提取生物学信息（GO分析和KEGG通路分析）。笔者将关键靶点基因输入DAVID数据库中进行GO富集分析，选择生物过程（biological process），分子功能（molecular function），和细胞组成（cellular component）3个模块。然后使用Cluego对关键靶点进行通路分析，选择KEGG，设定P<0.05以确定关键靶点富集通路。Cluego利用kappa统计学建立的，反映了基于相关基因之间相似性的关系。

2 结果

2.1 “活性成分——靶点”网络构建分析

将182个活性成分，774个靶点基因导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化。其中按度值排名前20的有quercetin，PTGS2，CALM1，HSP90AB1，ESR1，NOS2，AR，PPARG，F10，PRSS1，PAL_GLEAN10007028，kaempferol，NCOA2，ESR2，SCN5A，GSK3B，CDK2，PTGS1，CCNA2，MAPK14。

2.2 补中益气汤治疗糖尿病肾病的关键靶点收集

通过GeneCards平台收集糖尿病肾病相关靶点基因，与活性成分作用靶点取交集后最终获得41个关键靶点基因。关键靶点具体为：ACHE、ADIPOQ、ADRB1、APOB、BCL2、CREB1、CRP、CYP19A1、DPP4、DRD1、E2F1、EGF、ESR1、GSK3B、HAS2、HIF1A、HMGCR、HSPA5、HTR2A、IGF2、IL1B、JUN、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MMP2、MMP3、MPO、MTTP、NOS3、PLAT、PLAU、PPARD、PTGS1、SELE、SIRT1、SPP1、STAT3、THBD、VCAM1。

2.3 关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将关键靶点导入String数据库，将研究物种为选择为人类，将minimum required interaction score设置为大于0.9，获得蛋白基因互作关系。将结果TSV格式导出，再将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，绘制蛋白相互作用网络，其中度值越大，节点越大，度值排名前八的有STAT3，JUN，MAPK3，MAPK1，ESR1，CREB1，MAPK14，MAPK8，表明这些靶点在补中益气汤治疗糖尿病肾病中有着重大的作用。

2.4 关键靶点的GO分析

对关键靶点基因进行GO富集分析，根据FDR筛选得到22个条目（FDR<0.05），网络中的关键靶点通过激活细胞转录因子，调节细胞生物信号转导，调控葡萄糖代谢，血管生成，MAP激酶活性，脂多糖介导的信号通路等路径，在细胞外泌体，细胞间隙，细胞核中发挥作用。

2.5 KEGG通路分析

笔者采用Cytoscape中的插件ClueGO来对关键靶点进行通路富集分析。关键靶点主要集中在AGE-RAGE信号通路、Toll样受体信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、松弛素（Relaxin）信号通路。这些途径在氧化应激、炎症、肾纤维化等方面具有良好的作用。

综上所述，通过网络药理学预测补中益气汤防治糖尿病肾病的关键靶点及其相关信号通路，推测该方剂对糖尿病肾病的潜在作用机制，可能主要参与抗炎、调节糖脂代谢及氧化应激等过程，为阐明补中益气汤对糖尿病肾病的作用机制提供了科学依据。但本研究还存在一些缺陷，主要是未对预测获得的活性成分、关键靶点和有关通路进行实验验证。为了进一步深入探讨其复杂的过程和作用机制，本课题将会结合上述结果进行更深一步的实验研究。

参考文献：

[1]俞孝芳，李红.雌激素与糖尿病肾病[J].国外医学.内分泌学分册，2005（04）：265-267.

[2]马素珍，石宁，刘丹丹，冯黎，杨少文，朱艳琴.人CREB1基因及蛋白的生物信息学分析[J].生物技术，2016，26（06）：557-573.

基金项目：国家自然科学基金（81073111，81374029，81874359）;江苏省自然科学基金（BK20161371）;江苏省高校自然基金（18KJB36011）

作者简介：陈璟（1987-），男，汉族，在讀博士研究生，讲师，研究方向：中药药理与中药药剂。

*通讯作者：吕志阳（1983-），男，汉族，黑龙江人，博士，讲师，主要从事药物新型给药系统和适应性研究。