一氧化氮检测试剂盒的性能验证和临床应用评价

冯文强，易向民，关卓辉，陈碧霞

广东省广州市红十字会医院检验科，广东广州 510220

一氧化氮作为一种目前所知最强的血管内皮细胞舒张因子(EDRF)和新型生物信息递质，除具有扩张血管、降低血压、松弛平滑肌等活性外，还具有信号传递、酶活性调节、免疫调节及抗(致)氧化损伤等生物活性[1-2]。一氧化氮检测对疾病的临床辅助诊断、病情的跟踪分析与判定、临床治疗疗效动态跟踪和预后评价有重要的意义。此外，检测一氧化氮对疾病发病机制的探讨及有效地指导临床治疗也具有一定的价值。外源性一氧化氮供体药物或直接吸入一氧化氮气体治疗在心脑血管疾病(如动脉硬化、冠心病、高血压、脑卒中)、肺动脉高压(PH)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、阳痿(ED)等疾病中具有重要意义[3]，一氧化氮检测可以作为这些疗法疗效跟踪的辅助指标[4-5]。在本研究中，笔者采用福建福缘生物科技有限公司生产的一氧化氮检测试剂盒进行方法学评估和临床测试分析，以验证该试剂盒方法学的分析性能是否良好，以及是否符合临床使用要求。

1 资料与方法

1.1一般资料 搜集本院门诊及住院患者静脉血20例，黄色分离胶管3 600 r/min,离心8 min，2 h内完成检测。

1.2仪器与试剂 7600-020日立全自动生化分析仪，福建福缘生物科技有限公司生产的一氧化氮检测试剂盒。高、低水平样品和相关定值样品均由福建福缘生物科技有限公司提供，批号分别为NO-C-190108-01、NO-S-190108-01。

1.3方法 试验之前按照中华人民共和国医药行业标准对 7600-020全自动生化分析仪进行校准，严格按照仪器操作说明书的规定对仪器进行维护、保养及操作。

1.3.2正确度验证 选取定值样品进行测定，标示值为150、100、75、50、37 μmol/L，分别编号S1～S5,重复测定3次，计算测定结果和标示值的偏差。

1.3.3线性范围验证 选择高、低两个水平的标本(理想的高水平和低水平应在测量区间的高低两端)，按不同比例混匀上述两种水平，而得到不同稀释水平的标本,高水平标本(H),低水平标本(L)，重复测两次，计算两次结果的均值，以均值(Y)和预期值(X)进行直线回归分析，回归方程：Y=aX+b。根据线性回归方程式求出每一稀释度符合线性的理论水平，计算每一稀释度实测值和计算理论值的差异。

1.3.4生物参考区间验证 随机抽取20例健康查体标本为测试对象，均为查体后排除肿瘤、心脑血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、自身免疫性疾病的标本。根据实测结果来对照参考范围，观察该试剂的正常参考范围是否适用。

1.4统计学处理 采用Excel 2007表格软件进行数据统计，计算相关系数和回归方程。

2 结 果

2.1精密度验证结果 两个水平的精密度测定结果显示，低水平测定均值为43.4 μmol/L，s批内为1.6 μmol/L，CV批内为3.69%，s批间为2.1 μmol/L，CV批间为4.84%，与厂家声明的批间、批内CV≤5%相符。高水平测量均值为95.6 μmol/L，s批内为2.7 μmol/L，CV批内为2.82%，s批间为2.4 μmol/L，CV批间为2.51%，与厂家声明的批间、批内CV≤5%相符。

2.2正确度验证结果 用5个水平的定值样品进行测定，计算均值和偏倚，与厂家声明的允许偏倚范围(±10%)相符，见表1。

表1 正确度验证结果

注：S1～S5为标示值编号。

2.3线性范围验证结果 以均值(Y)和预期值(X)进行直线回归统计，计算得到回归方程：Y=0.982 5X-0.941 5，斜率(a)为0.982 5,在0.97～1.03;r2为0.999，r2>0.995符合要求，见图1。若不同水平处差异值都在厂家声称的允许差异百分数(差异限)内，可确认厂家声称的可测量范围是可接受的。根据产品的技术要求：在5～50 μmol/L，线性绝对偏差≤5 μmol/L；在50～400 μmol/L，线性相对偏差≤10%。根据以上试验结果可知，线性范围内偏差小于技术要求的规定(在5～50 μmol/L，线性绝对偏差≤5 μmol/L；在50～400 μmol/L，线性相对偏差≤10%)，符合产品技术要求。 见表2。

2.4生物参考区间验证结果 根据实测的结果来对照参考值区间(30～60 μmol/L)，观察该试剂的(正常)参考区间是否适用。测试结果见表3，由试验结果可知，20个临床结果中一氧化氮测试只有1个超出范围，符合临床使用要求。厂家提供的参考区间可作为本实验室的参考区间。

表2 线性范围系列水平标本测量结果

图1 线性回归方程

表3 参考区间验证结果

3 讨 论

一氧化氮是左旋-精氨酸(L-精氨酸)在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成的，它是一种小分子自由基，具有高度的亲脂性，使其具有穿透膜的特殊能力[8]，也是体内重要的效应和信使分子，对微循环的舒缩有重要的调节作用。不同类型的NOS催化合成的一氧化氮具有不用的生物学作用。一氧化氮能引起血管舒张，抑制白细胞与内皮细胞的黏附，抑制血小板聚集[9]。同时，一氧化氮也是一种毒性分子，过量的一氧化氮在身体发生炎症及免疫反应时，对机体产生损伤作用[10-11]。

人体血清中的一氧化氮在氧及水的存在下，可生成与该一氧化氮等摩尔水平的亚硝酸盐和硝酸盐。而在酸性介质条件下，亚硝酸盐和硝酸盐又能与多巴胺和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐反应，生成紫红色复合物，在最大吸收峰545 nm波长处读取吸光度值变化率，即可求出此时人体血清中亚硝酸盐和硝酸盐的总水平[12]。试剂的良好性能是保证检验结果准确、可靠的前提。试剂的性能验证是评价该检测系统是否能够用于临床检验工作的必要程序。本研究参考CLSI系列指导文件，结合工作实际，对一氧化氮检测试剂盒在7600-020全自动生化分析仪使用的精密度、正确度、线性范围、生物参考区间、检出限进行了验证和评价。参照CLSI EP15和WS/T 420-2013文件，连续检测5 d，每天检测1个分析批，两个水平，重复检测4次，计算结果可知CV在厂家声明范围之内。本研究采用厂家提供的正确度验证计划的质控品、其他第三方供应商提供的参考材料等,选择两个水平的参考材料，对每个参考材料分别在3～5 个不同批次中重复测量2 次，计算均值与指定值比较，估计偏倚，验证厂家声明，结果与厂家声明的偏倚相符。线性范围是评价试剂检测性能的重要指标之一[13]。选取接近厂家声明的线性范围的高值和低值标本，将高值与低值按比例配制成不同水平的混合标本用于线性范围验证，结果显示r2为0.999，说明该方法在试验所涉及的水平范围内呈线性，与厂家提供的线性范围相符。本研究采用20例健康者标本来验证，结果只有1例不在区间内，符合要求。为进一步检测该试剂盒的效能，本研究还增加了检出限检测，结果显示本试剂的检出限符合技术要求。由于不同实验室使用的仪器型号、检测系统不同，制订适合本实验室的检测方法十分重要。由于该一氧化氮检测试剂盒并非本实验室仪器配套试剂，关于一氧化氮检测的报道较少，因此需要在使用该试剂前根据本实验室情况进行验证[14]。本研究首次对一氧化氮检测试剂盒在7600-020全自动生化分析仪上进行性能验证，对本项目的开展提供了质量保证。当然，本研究只是对一氧化氮检测试剂盒进行了一般性能验证，在后续工作中将持续进行观察、完善，如干扰试验等。

综上所述，一氧化氮检测试剂盒在7600-020全自动生化分析仪上的主要性能与厂家声明相符，其重复性好、正确度高、线性良好、生物参考区间可靠、灵敏度高，可用于临床分析，为新项目的开展提供了质量保证。