水稻盐碱逆境响应锌指蛋白基因OsZFP6表达特性及功能研究

刘佳丽 何明良 刘晨曦 廖 栩 李秀峰 管清杰*

(1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040； 2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081； 3.中国科学院大学，北京 100049)

迄今为止，植物锌指蛋白在植物生长发育[18]、逆境胁迫[19～21]以及病原菌防御[22]过程中发挥重要作用。C2HC型锌指蛋白虽在植物体内发现，例如，水稻OsRZ1/2基因所编码C2HC型锌指蛋白，通过调节响应胁迫相关基因提高植株对低温的耐受性[21]。然而，其他基因所编码的C2HC型锌指蛋白功能及作用机制有待进一步研究。水稻即是继小麦之后的世界第二大粮食作物，也是生物学研究的模式植物，全世界50%人口数量以上的人都是以大米为主食。东北松嫩平原的苏打盐碱地作为我国的后备耕地为满足快速增长的人口粮食需求和产量提高而开发利用，而当今盐碱化加剧已是一个极其严峻的挑战。迄今为止，以稻治碱，水稻基因组的研究成功为选育抗盐碱水稻奠定了遗传基础。因此，挖掘新的耐盐碱基因对水稻品种的遗传改良以及提高粮食产量具有十分重要的意义。本研究通过在碱性盐胁迫下，明确OsZFP6蛋白在响应碱性盐逆境信号调节作用；确定OsZFP6蛋白发挥功能的场所；比较过表达OsZFP6基因水稻在碱性盐胁迫下耐受性变化，阐明OsZFP6蛋白参与调节水稻碱性盐胁迫下生长的遗传表型；将为明确水稻在碱性盐逆境下生长时，OsZFP6蛋白参与的一条耐受碱性盐胁迫的转录调节分子途径提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

水稻龙粳11(OryzasativaLongjing11)种子由中国科学院东北地理与农业生态研究所提供。

1.1.2 菌株与载体

大肠杆菌(E.coli)JM109、农杆菌EHA105由本实验室保存；pMD18-T vector购于TaKaRa公司；pBI121::GFP植物荧光表达载体由本实验构建完成，以及前期构建的重组植物表达载体pBI121::OsZFP6由本实验室提供。

1.1.3 实验试剂

地高辛标记试剂盒、CDP-Star显色剂购自于Roche公司；限制性内切酶、T4连接酶购自于TaKaRa公司；2×Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix、RNA提取试剂盒、Ex-Taq DNA聚合酶购自于北京康为世纪公司；Yeast extract粉末、Tryptone粉末购自于SIGMA公司；氨苄青霉素(Amp)购自于上海生物工程有限公司；其他试剂为中国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1OsZFP6基因的生物信息学分析

利用NCBI在线网站BLAST对克隆的OsZFP6基因进行同源性比对分析；利用MEGA7.0软件构建蛋白系统进化树；利用SnapGene4.2.3软件对OsZFP6蛋白进行分子量预测；利用在线网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)对OsZFP6蛋白保守结构域进行比对。并利用在线网站WebLogo(http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)对OsZFP6蛋白保守结构域作图分析。

1.2.2 实时定量PCR分析OsZFP6基因表达特性

提取分别用浓度为60 mmol·L-1NaHCO3、5 mmol·L-1H2O2处理后水稻的叶和根的总RNA。测得RNA浓度后，取1 μg总RNA为模版反转录cDNA，稀释100倍后作为定量PCR模版。设计内参基因以及OsZFP6特异性引物序列(Actin1-F:CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA,Actin1-R:CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA;OsZFP6-F1:CAAGCATCTCACCTCACAG，OsZFP6-R1:TAGGCACCTCTACACTCAT)，进行定量PCR反应，在MxPro-Mx3000P系统上进行数据采集，每个实验样品分别进行3次技术重复和3次生物学重复，结果数据用Origin软件进行分析。

1.2.3 水稻OsZFP6蛋白亚细胞定位分析

利用在线网站Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Target P)对OsZFP6蛋白发挥功能场所定位预测，通过水稻原生质体方法进行亚细胞定位实验验证。构建pBI121::OsZFP6::GFP重组质粒。将pMD18-T-OsZFP6测序正确的质粒为模版，设计特异性引物，进行PCR反应，胶回收产物与pMD18-T进行连接反应，连接产物的质粒和pBI121载体经过酶切反应后连接，重组质粒用KpnⅠ与SalⅠ进行酶切鉴定。

1.2.4 过表达OsZFP6水稻的遗传转化及NaHCO3抗性分析

1.2.4.1 转基因水稻的制备

参照1.2.3方法，将构建好的pBI121::OsZFP6::GFP重组质粒，转化农杆菌EHA105，并将工程菌株在含有50 mg·L-1卡那霉素(Kana)培养基进行活化。参考Toki S等人[23]方法，使用农杆菌介导对水稻愈伤组织侵染。

1.2.4.2 过表达OsZFP6水稻鉴定

(1)过表达植株T0代PCR检测。分别提取获得到的有卡那霉素抗性的7个不同株系的基因组DNA。根据植物过表达载体信息，设计特异性引物(OsZFP-F2：CTCGTGACCACCCTGACCTA；OsZFP-R2：TCGTCCATGCCGAGAGTGAT)。分别以7个不同株系DNA为模板，进行PCR检测。

(2)过表达植株OsZFP6相对表达量分析。取1 ng总RNA进行反转录，使用特异性引物(OsZFP6-F3:GTCGGAGAAGCAGTGGTAGG;OsZFP6-R3:GGCGAGTAGTTGCAGGTGAT)，以反转录产物cDNA为模板并参照1.2.2进行qRT-PCR分析。

(3)过表达植株卡那霉素抗性筛选。将收获的种子，依次经过70%乙醇30 s、3% NaClO3浸泡15 min，每5 min震荡一次。再用无菌水清洗至无NaClO3残留。随后将消毒后的种子浸泡在含有50 mg·L-1卡那霉素的无菌水中，在室温浸泡2 d后，放置28℃恒温培养箱进行催芽萌发，催芽期间每天更换含有卡那霉素的无菌水。最后，选取长势健壮的幼苗进行移栽。

1.2.4.3 过表达OsZFP6水稻对NaHCO3抗性分析

萌发7 d后，选取长势一致的幼苗。分别置于终浓度为0.0、5.0、7.5、10.0 mmol·L-1NaHCO3的1/8 MS营养液中，进行胁迫处理3 d，并每天进行更换处理液，胁迫结束后进行表型观察。对其株高、鲜重进行测量，对植株器官的丙二醛以及H2O2含量进行测量：采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法[24]对植株组织器官中丙二醛含量进行测定，采用硫酸钛比色法对植株组织器官内H2O2含量进行测定[25]。

2 结果与分析

2.1 水稻OsZFP6基因的生物信息学分析

经过网站NCBI对比鉴定分析，结果表明OsZFP6基因全长1 560 bp，其中5′和3′端非编码区长度分别是458和186 bp，其编码蛋白核酸分子量为33.6 kDa，等电点为6.75。软件预测结果表明该基因ORF区域包含915 bp编码304个氨基酸(图1a)，OsZFP6基因在216～232 bp，存在锌指蛋白结构域(图1b)，通过对OsZFP6蛋白(登录号BAG90927)保守结构域进行序列比对，结果表明保守基序列为C-X2-C-X4-H-X4-C(详见图1c)。

2.2 OsZFP6基因在时间与空间的表达特性分析

本研究检测OsZFP6在胁迫处理后的水稻幼苗中的表达量(图2a)，植株经过H2O2处理后，OsZFP6在叶片中表达量明显提高，在经过胁迫处理12 h后，处理组基因表达量是对照组的2.8倍，在48 h时表达量开始下降。植株经过NaHCO3处理后(图2b)，OsZFP6在叶片中表达量明显提高，在经过胁迫处理24 h后，基因表达量是对照组的2.9倍，在48 h时表达量开始下降。

图1 OsZFP6氨基酸序列、结构域以及锌指蛋白保守序列分析 a.OsZFP6蛋白氨基酸序列分析；b.OsZFP6蛋白保守结构域模型；c.OsZFP6蛋白的C2HC锌指蛋白保守序列Fig.1 Analysis amino acid sequence, conserved domains and conserved sequence of zinc finger protein of OsZFP6 a.The amino acid sequence of OsZFP6; b.The schematic of conserved domains of OsZFP6; c.Conserved sequence of C2HC zinc finger protein of the OsZFP6 protein

图2 逆境胁迫下的OsZFP6基因表达特性分析 a.H2O2胁迫处理后OsZFP6表达分析；b.NaHCO3胁迫处理后OsZFP6表达分析 误差线表示3个技术重复的标准误差。Fig.2 Analysis expression of OsZFP6 under stress a.Analysis expression of OsZFP6 under H2O2 stress; b.Analysis expression of OsZFP6 under NaHCO3 stress Error bars indicate the SD of three biological replicates.

2.3 水稻OsZFP6蛋白亚细胞定位分析

2.3.1 亚细胞定位预测分析

经过对该基因所编码的蛋白发挥功能的场所进行预测，其发挥功能的场所是细胞核的可能性最大，其可能性达到73.9%(见表1)，推测OsZFP6蛋白是属于主要在细胞核区域发挥功能的转录因子。

表1 OsZFP6蛋白亚细胞定位预测

2.3.2 亚细胞定位检测

为了进一步研究OsZFP6蛋白的功能，我们采用水稻原生质体转化的方法对其进行亚细胞定位分析，通过检测绿色荧光蛋白发光信号(如图3所示)，验证表明发现OsZFP6蛋白发挥功能的场所在细胞核。

2.4 过表达OsZFP6水稻分子鉴定与筛选

为了研究OsZFP6基因功能，获得了OsZFP6的过量表达转基因植物，为了验证植株与基因35S::OsZFP6整合情况，在获得过表达T0代具有卡那霉素抗性的植株中，提取幼嫩叶片基因组DNA。同时，以pBI121::OsZFP6::GFP质粒和野生型水稻(龙粳11)DNA分别做阳性、阴性对照进行PCR扩增。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分析(详见图4)，只有阴性对照并没有扩增出目的条带。结果表明OsZFP6已经整合到水稻基因组DNA上，所获得植株为转基因植株。

为了验证带有卡那霉素抗性的阳性植株基因表达情况，确保过表达OsZFP6基因正常发挥功能，我们进一步对阳性植株进行qRT-PCR分析。结果如图5所示，通过正常条件下培养的植株的表达量分析。在所获得的卡那霉素抗性的植株中，在转基因植株中OsZFP6基因相对表达量明显提高。在50 mg·L-1卡那霉素中对T3代过表达水稻进行抗性筛选萌发，萌发结果如图6所示，过表达OsZFP6不同株系的生长情况明显优于对照株系，然而过表达株系之间生长情况差异不明显。结果表明成功获得过表达植株，可进行相关胁迫实验。

图3 OsZFP6蛋白在水稻原生质体亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of OsZFP6 protein in rice protoplast

图4 转基因植株T0代株系PCR鉴定 M.DNA Marker；CK+、CK-分别为阳性对照和阴性对照；#1～#7. 7个T0不同株系Fig.4 PCR detection of transgenic T0 lines M.DM2000 Marker; CK+.The plasmid used as a positive control; CK-.WT DNA used as a negative control; #1-#7.The transgenic T0 lines

图5 转基因植株T0代株系转录表达鉴定 WT.野生型植株；#1～#7. 7个T0不同株系 误差线表示3个技术重复的标准误差。Fig.5 Accumulation of OsZFP6 transcripts in overexpressed lines and wild type lines WT. Wild type; #1-#7.The transgenic T0 lines Error bars indicate the SD of three biological replicates.

图6 转基因植株T3代卡那霉素抗性筛选 NT.野生型植株；#1～#5.不同株系Fig.6 Screening kanamycin resistance of transgenic plants in T3 generation NT.Non-transgenic plant; #1-#5.The transgenic lines

图7 过表达植株与非转基因植株在NaHCO3处理3 d后表型分析 NT.非转基因植株；#1～#5. T4代不同株系Fig.7 Phenotype of OsZFP6 overexpressed and non-transgenic plants after treatment with NaHCO3 for 3 days NT.Non-transgenic plants; #1-#5.The different lines of T4

图8 NaHCO3敏感性实验分析植株生理指标测量 A.植株株高测量；B.植株鲜重测量；C.丙二醛含量测量；D.H2O2的测量 误差线表示3个技术重复的标准差，大写字母代表图片顺序，小写字母代表差异显著性(P<0.05)。Fig.8 Measurement of physiological indices based on sensitivity analysis of NaHCO3 sensitivity assays A.The height of lines; B.The fresh weight of lines; C.The contents of MDA in lines; D.The H2O2 levels of lines Error bars indicate the SD of three biological replicates,capital letters represent the order of pictures,and lowercase letters represent differences in significance(P<0.05)

2.5 过表达OsZFP6水稻对NaHCO3抗性分析

将收获5个株系的T3的种子和龙粳11野生型种子，萌发7 d后选取长势一致的幼苗。分别置于终浓度为0.0、5.0、7.5、10.0 mmol·L-1NaHCO3的1/8MS营养液中，进行胁迫处理3 d后进行表型观察。结果表明(如图7所示)，植株在正常的条件下，在表型上，NT植株与过表达OsZFP6水稻没有差别。随着NaHCO3浓度的增加，NT植株生长受到抑制比过表达OsZFP6水稻明显，并且过表达水稻之间生长情况差异不明显。

通过对其株高、鲜重以及植株体内丙二醛及H2O2含量测定，结果如图8所示，NT水稻植株和过表达植株在正常的条件培养下，通过比较鲜重、株高、植株体内的丙二醛以及H2O2含量，两者之间差异不明显。在随着NaHCO3浓度的增加，在鲜重、株高生理指标上，NT水稻植株与过表达OsZFP6水稻植株都呈现下降趋势，但过表达OsZFP6水稻的鲜重、株高都优于NT植株，并且过表达水稻之间情况差异不明显。同时，NT植株以及过表达OsZFP6水稻体内丙二醛以及H2O2都呈现上升趋势，但过表达OsZFP6水稻植株体内丙二醛以及H2O2低于NT植株，并且过表达水稻之间情况差异不明显。结果表明：在过表达OsZFP6水稻的幼苗期，过表达OsZFP6能够增强水稻对NaHCO3的耐受性，为选育水稻新品系提供参考依据。

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