一种高效的白桦树皮中白桦脂醇分离、纯化方法

李 影 李林夕 张玉琦 王 宇 詹亚光,2 尹 静,2*

(1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，生命科学学院，东北林业大学，哈尔滨 150040； 2.林木遗传育种与生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150040)

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)是桦木科(Betulaceae)桦木属(BetulaLinn.)植物，为耐寒落叶乔木[1]。其树皮成分复杂，药理活性多样，早在李时珍《本草纲目》中就有记载，桦木皮可用来治疗黄痕、济疫、乳痈、止咳治急、慢性痢疾等疾病[2～3]。近年来研究显示，白桦树皮提取物白桦三萜物质具有抗菌、抗病毒、利胆和保肝等重要作用,抗疟疾、消炎和抗肿瘤活性,尤其在抗艾滋病病毒活性及抗各种肿瘤细胞系细胞毒性[4～5]，高效低毒，被认为是最具潜力的药物先导化合物。白桦树皮三萜主要成分白桦脂醇和白桦脂酸的抗炎性已在体外和体内模型体系中被验证，主要通过对非神经基因路径的抑制来达到，也可能是由于白桦脂酸与糖皮质激素受体相互作用[6～7]。白桦脂醇可以抑制AC16心肌细胞炎症通路NF-κB和炎症相关基因的表达，从而起到对心肌细胞的保护作用[8],对酒精性肝损伤有较好的治疗作用[9]，能够缓解体力疲劳和提高缺氧耐受力的作用[10]；同时白桦脂醇可以促进细胞增殖，通过提高Col合成及相关蛋白酶的表达等途径起到对皱纹修复的作用。另有研究表明，白桦脂醇具有抗抑郁、抗焦虑作用，并具有良好的免疫调节作用[11～12]。

1788年，Lowit首次报道白桦树皮中含有白桦脂醇，并将其分离出来。自此，有关白桦中其他化学成分的研究陆续被报道。白桦脂醇在桦树皮中的含量为10%～35%，主要以晶状沉积物的形式在白桦树皮外层中存在，白桦树皮之所以是白色也是因为白桦脂醇几乎充满了它的表皮细胞的内部空间。白桦脂醇在白桦不同部位的含量分布差异显著，依次为：外皮>枝皮>内皮>芽>叶>根>花粉[13]。目前，实验室和工厂提取的白桦脂醇大多是来自植物，例如白桦中直接提取，提取的方法也是多种多样，三萜化合物(不包括皂苷)没有一个统一的提取方法[14]，实践生产中难以选择使用。从白桦树皮中制备白桦脂醇一般可分为两大步，即溶剂回流提取和重结晶提纯。祁逸梅[15]等提取白桦脂醇，用乙醇溶液加热回流大约5 h，将提取液减压蒸馏之后用乙醇重结晶2～3次，初提物用甲醇/氯仿(1∶1)重结晶，得到白色针状的白桦脂醇固体。卢福强等[16]将白桦树皮粉碎，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，过硅藻土柱，使用乙酸乙酯洗脱，洗脱液回收乙酸乙酯至干，加入15倍95%乙醇过滤，干燥，干燥样品中白桦三萜类物质含量在98%以上。栗巧云[17]使用D101型大孔吸附树脂对白桦三萜分离纯化，结果表明，其干燥品中白桦脂酸类三萜化合物含量可达74.27%。除此之外，白桦脂醇的提取还有超临界二氧化碳萃取和超声辅助提取等[18～19]。综上所述，白桦脂醇的提取和纯化方法较多，但没有一种公认的效率高、纯度高的统一的标准方法，实践中难以选择。本实验将对上述方法进行综合、比较、优化，以期筛选最佳的白桦脂醇提取、纯化的方法，为白桦脂醇类产物进一步充分利用提供一种高效、简便的提取纯化的方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料

白桦树皮来自东北林业大学约50年树龄白桦植株外皮。

1.2 白桦脂醇提取方案比较

将5.00 g干燥后的白桦树皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入锥形瓶中，按照以下3种提取方案进行白桦脂醇的提取。

方案一：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL：g)浸泡24 h(对照组)、72、120、168 h；超声振荡5 min，用滤纸过滤，收集滤液；滤液50℃加热回流5 h；常压，用坩埚50℃水浴蒸馏，得到粗提物。

方案二：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h；超声振荡15 min，用滤纸过滤，收集滤液。取消超声振荡为对照组；滤液50℃加热回流5 h；50℃减压蒸馏至圆底烧瓶剩少许，此时为了防止产物被吸出，换坩埚在常压水浴50℃蒸干，得到粗提物。

方案三：用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，过滤，滤渣用8倍量95%乙醇回流提取3 h，合并滤液；使用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇。得到浓缩后的粗提物液体；过滤，常压50℃水浴蒸干，得到粗提物。

1.3 白桦脂醇的重结晶

根据上述1.2所得优化提取方案，选择将15 g干燥的白桦树皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入锥形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后过滤，将滤液50℃加热回流5 h，减压蒸馏，将液体转移到坩埚中继续蒸干，得到初提物，待重结晶使用，重结晶采用下述3种方法。

1.3.1 甲醇—氯仿重结晶法

将提取液减压蒸馏之后用乙醇重结晶3次，再用甲醇/氯仿(1∶1)重结晶，1 g粗产品需要40 mL的甲醇—氯仿溶液；静置过夜；抽滤，得到白色针状的白桦脂醇固体。

1.3.2 无水乙醇重结晶法

以70 mL乙酸乙酯为溶剂，加热回流90 min，趁热过滤。滤液使用坩埚50℃浓缩至干。以无水乙醇为溶剂进行重结晶，无水乙醇∶固体=30 mL∶1 g，-20℃重结晶。室温下过滤、50℃烘干。

1.3.3 吸附层析法

使用D101型大孔吸附树脂吸附层析，使用乙酸乙酯洗脱，洗脱液回收乙酸乙酯至干，加入15倍无水乙醇加热溶解，0℃以下冷沉，过滤，干燥。

1.4 高效液相色谱法(HPLC)检测提取物中白桦脂醇的含量

分别取0.10 g以上3种重结晶方法得到的提取物，加入适量的甲醇使其完全溶解。分别取2 mL溶解液，利用0.45 μm有机滤膜滤过，作为样品检测液。以1 mg·mL-1的白桦脂醇标品作为对照，利用高效液相色谱进行检测。高效液相色谱(HPLC)检测条件：用Waters公司1525-2707-2489色谱系统，色谱柱HiQ sil C18V 4.6 mm×250 mm；流动相为乙腈∶水=9∶1(V∶V)；柱温25℃；灵敏度16 AUFS；进样量20 μL，流速1.0 mL·min-1；检测波长210 nm。

白桦脂醇回归方程为:y=(x-68 020)*10^-6/9,R2=0.999 4。结果表明，白桦脂醇在0.2～5.0 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

2 结果与分析

2.1 白桦脂醇的提取方法比较

2.1.1 浸提时间对白桦脂醇含量提取的影响

根据方案一，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸提，探讨不同浸泡时间对白桦脂醇提取含量的影响。将浸泡时间分别延长为72、120和168 h进行实验，浸提24 h为对照。除浸泡时间不同外，其他操作均相同。

分析结果表明(见图1)，适当延长的浸泡时间有利于粗提物产量的提高，当浸泡时间为120 h时，白桦树皮(5.00 g干样)粗提物产量显著提高，为1.00 g，初提物产率为20%。而当时间延长至168 h，粗提物的产量并无提升，可能有所降解。表明白桦树皮回流提取前最佳浸泡时间为120 h。

图1 不同浸泡时间对白桦脂醇初提物的产量的影响Fig.1 The effect of different soaking time on the yield of the initial extract of betulin

图2 超声振荡对白桦脂醇初提物产量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic oscillation on yield of the initial extract of betulin

2.1.2 超声振荡对白桦脂醇提取的影响

根据方案二，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h。超声振荡15 min，频率40 Hz，对照为不进行超声处理。超声振荡与否对白桦树皮粗提物的产量并无显著影响，可能的原因是120 h的充分浸提时间足以保证粗提物的获得。同时也发现由于超声振荡使得白桦树皮的浸提物变得浑浊给过滤增加了困难，延长了过滤的时间(如图2所示)。

2.1.3 利用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇对白桦脂醇产量影响

根据方案三，用10倍量95%乙醇回流提取5 h，过滤，滤渣用8倍量95%乙醇回流提取3 h，合并滤液。再使用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇。得到浓缩后的粗提物液体。过滤并在50℃水浴蒸馏至干，得到初提物0.81 g，提取率为16.2%。

通过上述3种方案的比较，白桦树皮最佳浸泡时间为120 h；此后不再需超声振荡，使用旋转蒸发仪可以大大缩减蒸馏的时间，回收提取液，节约环保。所以，确定白桦脂醇回流提取的最佳方案为：将5 g干燥的白桦树皮剪成近似1 cm的方形碎片，放入锥形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后，过滤，将滤液50℃加热回流5 h，减压蒸馏，得到初提物固体约1 g，提取率为20%。

2.2 白桦脂醇的重结晶方法比较

根据上述2.1所得的结果，我们选择将15 g干燥的白桦树皮剪成近似1 cm的方形碎片，按照2.1中所述的最佳白桦脂醇提取方案得到初提物固体3.21 g。

2.2.1 甲醇—氯仿重结晶法

将0.50 g初提物用乙醇重结晶3次，得到白桦脂醇的粗产品。粗产品再用甲醇/氯仿(1∶1)重结晶，1 g粗产品约需40 mL的甲醇和氯仿溶液。静置过夜，抽滤，得到白色针状的固体0.04 g(图3A)，重结晶率为8%。使用此法提取得到的白色粉末状物质，可供后续实验使用。

2.2.2 无水乙醇重结晶法

将0.50 g初提物以70 mL乙酸乙酯为溶剂，加热回流90 min，趁热过滤。滤液使用坩埚50℃浓缩至蒸干。以无水乙醇为溶剂进行重结晶，无水乙醇(mL)∶固体(g)=30∶1。使用无水乙醇15 mL，-20℃重结晶。室温下过滤、50℃烘干。得到白色粉末状的白桦脂醇固体0.19 g(图3B)，重结晶率为38%。

2.2.3 大孔吸附树脂层析法

将0.50 g初提物使用D101型大孔吸附树脂吸附层析，使用乙酸乙酯洗脱，洗脱液回收乙酸乙酯至干，加入15倍无水乙醇加热溶解，0℃以下冷沉，过滤，干燥。得到奶白色固体粉末0.4 g。重结晶率为80%(图3C)。

图3 3种重结晶方法得到的白桦脂醇粉末 A～C分别为甲醇—氯仿重结晶法，无水乙醇重结晶法和吸附层析重结晶法得到的产物。Fig.3 Powdery substance of betulin obtained by three recrystallization methods A-C are respectively methanol-chloroform recrystallization,anhydrous ethanol recrystallization and adsorption chromatography recrystallization.

表1 白桦脂醇初提物重结晶的产量及产率

Table 1 Yield and yield of recrystallization of the initial extract of betulin

白桦脂醇产量Production of betulin(g)白桦脂醇产率Yield of betulin(%)甲醇—氯仿Methanol-chloroform0.040.8无水乙醇Absolute ethanol0.1938吸附层析Adsorption chromatography0.4080

图4 白桦脂醇初提物重结晶的产量Fig.4 Productivity of recrystallization of the initial extract for betulin

初提物重结晶的产量及产率计算结果显示(见图4)，利用D101型大孔树脂吸附层析得到的提取物产率最高，为80%。其次是利用无水乙醇重结晶法得到的提取物，为38%。产率最低的是甲醇—氯仿重结晶法，为8.0%。

2.3 高效液相色谱检测

2.3.1 HPLC检测提取物种类

HPLC的结果显示，白桦脂醇标品在8.714 min出峰，通过甲醇—氯仿重结晶法纯化得到的产物有5个峰，白桦脂醇占36.07%；通过无水乙醇重结晶法纯化得到的产物有3个峰，白桦脂醇占66.49%；通过吸附层析法纯化得到的产物有7个峰，白桦脂醇含量占58.71%。由此可知，通过无水乙醇重结晶法纯化得到的产物杂质种类较少，且白桦脂醇的含量远远高于杂质的含量。

图5 白桦脂醇标准品Fig.5 Betulin standard

图6 甲醇—氯仿重结晶得到白桦脂醇Fig.6 Betulin obtained by recrystallization of methanol-chloroform

图7 无水乙醇重结晶得到白桦脂醇Fig.7 Betulin obtained by recrystallization of absolute ethanol

图8 吸附层析法重结晶得到白桦脂醇Fig.8 Betulin obtained by recrystallization from adsorption chromatography

2.3.2 HPLC检测提取物中白桦脂醇的含量

称取利用无水乙醇重结晶法得到的提取物，溶于10 mL甲醇中，提取物溶液浓度为1.13 mg·mL-1，标为T1；从中取出1 mL装于试管中再用甲醇稀释10倍，此时提取物溶液浓度为0.113 mg·mL-1，标为T2；从中取出1 mL装于试管中再用甲醇稀释10倍，此时提取物溶液浓度为0.0113 mg·mL-1，标为T3。上述T1、T2、T3液体用HPLC检测。结果显示，利用无水乙醇重结晶法纯化得到的白桦脂醇的纯度在94.9%以上，最高纯度可达99.80%以上(详见表2)。同时通过此法也能获得较高纯度的白桦脂醇的下游产物白桦脂酸(见图7)，可作为进一步的标准品使用。

表2 HPLC检测提取物中白桦脂醇的含量及纯度

Table 2 Determination of the content and purity of betulin in extract by HPLC

名称Name面积(微伏·秒)Area(miV·s)含量Content(mg·g-1)纯度Purity白桦脂醇Betulin(0.5mg·mL-1)3103434/1T19719680949.032448494.90%T21083504985.191740498.51%T3168214998.509341299.80%

3 讨论

白桦脂醇及其衍生物具有重要的抗肿瘤和抑制艾滋病毒活性，关于其来自白桦树外皮的提取和纯化的方法成为其实践应用的关键环节。李正华[20]以100%乙醇70℃超声波(40 Hz,150 W)提取白桦树皮样品60 min，提取含量在14.51%～17.56%，优点是提取方法简便，但得率稍低；丁为民[21]利用超临界二氧化碳流体萃取法提取白桦脂醇，平均提取率可达到23.33%，纯度达到55.77%；利用无水乙醇，在液固比(mL∶g)为30∶1的条件下，进行重结晶，白桦脂醇的纯度均大于95%，最高可达98.13%，重结晶得率为26.61%～34.00%；周宏建[22]用乙醇作提取剂，固液比(g∶mL)为0.083,抽提时间6 h，分别用异丙醇和乙醇作溶剂，通过两步重结晶操作，得到白桦脂醇的产率达19.8%，纯度达98%，但重结晶产率较低；张静[23]等采用亚临界提取法，亚临界提取压力6 MPa、130℃、液固比(mL·g-1)为40∶1、提取时间12 min得到白桦脂醇最佳得率为3.09%，初提物得率较低，可能与提取时间较短有关；冯亚亚[24]利用乙酸乙酯、77℃、料液比1∶20，提取7 h，得率为22.8%，纯度为83.43%；赵国玲[25]利用氯仿/NaOH两相溶剂提取法，得率为14.32%，纯度可达到91.89%。

本研究综合比较上述提取、纯化的方法，获得了白桦脂醇提取的最佳方案。即将5.00 g干燥的白桦树外皮剪成近似1 cm的方形碎片(白桦树最外皮白色薄皮，直径1～2 mm，大量取材时建议进一步采用白桦树皮粉碎成粉末再提取白桦脂醇等三萜物质)，放入锥形瓶中，用95%乙醇溶液，液固比50∶1(mL∶g)浸泡120 h后，用滤纸过滤，收集滤液，将滤液50℃加热回流5 h，减压蒸馏约3 min，蒸馏烧瓶中剩余些许液体，将液体转移到坩埚中继续蒸干，得到米白色固体1.00 g。接着以70 mL乙酸乙酯为溶剂，将得到的固体加热回流90 min。滤液使用坩埚50℃浓缩至干。再以无水乙醇为溶剂进行重结晶，无水乙醇∶固体=30 mL∶1 g，-20℃重结晶，重结晶得率可达38.00%。室温下过滤后50℃烘干，最终得到白色固体，即为白桦脂醇，纯度在94.90%以上，最高可达到99.81%。这种优化后的白桦脂醇提取方案，同以往的提取方法相比，获得的产物纯度更高，产量也较高，而且操作简单，试剂毒性低，所用仪器较为常见，方便安全，为进一步的规模化提取白桦脂醇及白桦脂醇和白桦酯酸的标准品的获得提供了一种方便、安全、有效的方法。