石韦提取物抗氧化及抑制亚硝化作用研究

庄远杯，凌梅娣，詹佳虹，李榕娣，张 超，魏爱红，张声源*

1嘉应学院医学院；2嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所，梅州 514031

自由基的化学性质活泼，可攻击细胞内DNA、蛋白质、脂质等多种生物分子，导致细胞膜、遗传因子严重损伤，进而诱发癌变、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病[1-2]。天然抗氧化剂广泛存在于果蔬和药用植物中，能够保护机体免受自由基诱导的氧化应激损伤，相对于合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)及叔丁基对苯二酚(TBHQ)，具有安全、低毒等特点。亚硝胺的前体物质，如亚硝酸盐和胺类，广泛存在于腌制食物中，两者在胃液酸性条件下极易发生亚硝化反应转化为强致癌物—亚硝胺，进而引起鼻咽癌、食道癌、胃癌等多种器官恶性肿瘤，甚至通过胎盘屏障使下一代致癌[3]。清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是预防亚硝胺所致癌症的一项有效途径。现代药理研究表明，许多天然成分如黄酮类[4]、酚类[5]等能起到清除体内亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的作用，从而达到预防癌症的效果。从天然产物中挖掘安全低毒的抗氧化剂和抑制亚硝化剂已成为食品科学领域的研究热点。

石韦(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia)的多年生草本植物，又名石皮、金星草，主产广东、浙江、湖北等地，始载于《神农本草经》，为《中国药典》收载，具有利尿通淋，清肺止咳，凉血止血等功效，临床用于治疗热淋，血淋，石淋，小便不通等[6]。现代研究表明，石韦含有黄酮类、多酚、总皂苷、多糖等药用成分，其中黄酮类、多酚类成分含量较高，具有抗菌、抗肿瘤、调节免疫功能、降血压、降血糖等药理活性[7,8]。国内外学者研究显示，同属植物有柄石韦具有良好的抗氧化活性[9-11]。但对石韦抗氧化活性和抑制亚硝化活性及其与总酚、总黄酮含量相关性的研究未见报道。

本实验以石韦为研究对象，系统溶剂萃取分离，测定各提取物的总酚、总黄酮含量，比较各溶剂提取物的抗氧化活性和抑制亚硝化活性，并分析成分含量与活性的相关性，为石韦抗氧化活性和抑制亚硝化活性成分的分离指导提供实验基础，为开发利用石韦作为防癌抗癌保健食品和天然抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材石韦(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)于2016年4月采自广东省梅州市阴那山自然保护区，经鉴定为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia)多年生草本植物。

没食子酸标准品(上海金穗生物科技有限公司；批号20160410)；福林酚试剂(上海金穗生物科技有限公司；批号2016108)；芦丁标准品(成都昂赛斯生物科技有限公司；批号20160815)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH；美国Sigma公司；批号STBB0829V)；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS；美国Sigma公司；批号K1517067)；维生素C(Vc；西陇科学有限公司；批号20161213)；硝酸铝(天津市科密欧化学试剂有限公司；批号20150202)；过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、无水三氯化铁、无水柠檬酸、对氨基苯磺酸、二甲胺、1-萘胺、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；试剂均为分析纯。

UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；WFT-203B三用紫外线分析仪(上海精科实业有限公司)；N-1100V型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；FA2004型电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；TG16-WS台式高速离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司)；JP-100S型超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；WJX-A1000型多功能摇摆粉碎机(上海缘沃工贸有限公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 石韦醇提取物及不同溶剂提取物的制备

石韦2.0 kg，经50 ℃烘干，粉碎，用2倍量的95%乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(230 g)。取浸膏200 g分散于适量蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得石油醚提取物(PL-P，25 g)，乙酸乙酯提取物(PL-E，66 g)，正丁醇提取物(PL-B，53 g)，水提取物(PL-W，50 g)，置于玻璃真空干燥器中保存备用。

1.2.2 总酚含量测定

Folin-酚法测定总酚含量[12]。精密称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品20.0 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL棕色量瓶中，得质量浓度为0.2 g/L没食子酸标准溶液。分别精密移取没食子酸标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL棕色具塞比色管中，依次加入6.0 mL蒸馏水，0.5 mL福林试剂，充分摇匀，室温避光静置2 min，再加入2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，蒸馏水至刻度，混匀后常温避光反应90 min，于波长760 nm处测定吸光度。各提取物的总酚含量参考没食子酸(gallic acid，GA)标准曲线用没食子酸当量(每克干样品中酚类化合物相当于没食子酸的毫克数，mg/g)表示。每个提取物平行测定3次。

1.2.3 总黄酮含量测定

硝酸铝法测定总黄酮含量[13]。精密称取芦丁标准品20.0 mg，用60%乙醇溶解并定容至100 mL棕色量瓶中，得质量浓度为0.2 g/L芦丁标准溶液。分别精密移取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL棕色具塞比色管中，依次加入蒸馏水至7.0 mL，5 %亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，静置4 min，加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀，静置4 min，加入4 %氢氧化钠试液10.0 mL，再加蒸馏水至刻度，摇匀，放置10 min，于波长500 nm处测定吸光度。各提取物的总黄酮含量参考芦丁(rutin,RT)标准曲线用芦丁当量(每克干样品中黄酮类化合物相当于芦丁的毫克数，mg/g)表示。每个提取物平行测定3次。

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH法

DPPH自由基清除能力的测定参考文献[14]，稍作改进。分别精密移取1.0 mL不同质量浓度的样品和Vc溶液于10 mL试管中，分别加入0.1 mmoL/L DPPH甲醇溶液1.0 mL，室温避光静置20 min，以甲醇作为空白对照，于波长517 nm处测定吸光度(Ai)；同时测定1.0 mL DPPH甲醇溶液与1.0 mL甲醇溶液混合后在波长517 nm处的吸光度(A0)；测定1.0 mL甲醇溶液与1.0 mL样品溶液在波长517 nm处的吸光度(Aj)；每个样品平行测定3次。根据公式(1)计算出石韦不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(1)

1.2.4.2 ABTS法

ABTS自由基清除能力测定参考文献[15]，稍作改进。将7.0 mmoL/L的ABTS溶液与2.45 mmoL/L过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光静置12～16 h，制备ABTS自由基母液。用10 mmoL/L(pH7.4)磷酸缓冲溶液将ABTS自由基母液稀释，使其在波长734 nm处吸光度达到0.70±0.02。分别将0.1 mL不同质量浓度样品溶液和Vc溶液加入4.0 mL ABTS自由基溶液中，振荡30 s后室温静置10 min，于波长734 nm处测量吸光度(Ai)；同时测定4.0 mL ABTS自由基溶液与0.1 mL甲醇溶液混合后在波长734 nm处的吸光度(A0)；测定4.0 mL(10 mmoL/L；pH 7.4)磷酸缓冲溶液与1.0 mL样品溶液在波长734 nm处的吸光度(Aj)；每个样品平行测定3次。根据公式(2)计算出石韦不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除率。

ABTS自由基清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(2)

1.2.4.3 普鲁士蓝法

铁还原力的测定参考文献[16]。分别精密移取2.0 mL 不同质量浓度的样品和Vc溶液于10 mL试管中，再分别加入2.0 mL 磷酸缓冲溶液(2.0 mol/L，pH6.6)和2.0 mL 1%铁氰化钾，摇匀，于50 ℃恒温水浴20 min后取出急速冷却，再分别加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液。将上述溶液离心10 min(6 000 rpm)，取上清液2.0 mL，加入1.5 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1% FeCl3溶液混匀，静置10 min后于700 nm测定吸光度，每个样品平行测定 3 次，铁还原力大小用每克样品的Vc当量表示(μmoL/g)。

1.2.5抑制亚硝化活性研究

1.2.5.1 盐酸萘乙二胺法

亚硝酸盐清除率的测定参考文献[17]。pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液2.0 mL，分别加入不同质量浓度的样品和Vc溶液1.0 mL，5 μg/mL的亚硝酸钠溶液2.0 mL于25 mL比色管中，在37℃水浴1 h，取出，立即加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置3～5 min，各加1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液。加蒸馏水至刻度，混匀，静置15 min，在538 nm下测定吸光度，每个样品平行测定 3 次。根据公式(3)计算出石韦不同溶剂提取物对亚硝酸盐的清除率。

亚硝酸盐清除率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(3)

式中：A0为空白对照组的吸光度值(蒸馏水代替样品溶液)；Ai为样品组的吸光度值；Aj为未加亚硝酸钠溶液的吸光度值(蒸馏水代替亚硝酸钠溶液)，下同。

1.2.5.2α-萘胺法

亚硝胺合成阻断率的测定参考文献[18]。分别移取不同质量浓度的样品和Vc溶液5.0 mL于25 mL比色管中，加入pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10.0 mL、1 mmoL/L NaNO2溶液1.0 mL、1 mol/L的二甲胺溶液1.0 mL，加入蒸馏水至25.0 mL，在37 ℃下恒温1 h。吸取1.0 mL上述溶液至25 mL小烧杯中，加入质量分数0.5% Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析仪上(254 nm)照15 min。取出后加入质量分数1%对氨基苯磺酸1.5 mL，再加入质量分数0.1%α-萘胺1.5 mL、蒸馏水0.5 mL，摇匀，静置15 min，在最大吸收波长525 nm处测定吸光度，每个样品平行测定3次。根据公式(4)计算出石韦不同溶剂提取物对亚硝胺合成的阻断率。

亚硝胺合成的阻断率=

[1-(Ai-Aj)/A0]× 100%

(4)

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 石韦各提取物总酚和总黄酮含量

没食子酸标准曲线如图1所示，线性拟合方程Y=0.104 6X+ 0.032 2，R2=0.997，线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线

芦丁标准标准曲线如图2所示，线性拟合方程Y=0.013 3X-0.007 2，R2=0.997，线性关系良好。

图2 芦丁标准曲线

石韦4个不同溶剂提取物总酚和总黄酮含量如表1所示。结果显示，总酚和总黄酮在不同溶剂提取物中的含量差异显著(P<0.05)，且总酚和总黄酮含量大小均为PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其PL-B中的总酚、总黄酮含量最高，分别为29.85±2.15和37.23±2.41 mg/g，明显大于其余3个提取物。表明正丁醇可高度富集石韦醇提取物中的酚类和黄酮类成分，对PL-B的进一步分离纯化以研究石韦酚类和黄酮类成分具有重要的指导意义。

表1 石韦不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量

注：同行肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note:Different data in the same row means significant difference(P<0.05),the same below.

2.2 体外抗氧化活性测定结果

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

石韦不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除率测定结果见图3、表2。由图3可知，在40～200 μg/mL的质量浓度范围内，石韦各溶剂提取物对DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，清除率随质量浓度的增大而增大，呈一定的量效关系。在相同质量浓度下，PL-B对DPPH自由基的清除率最高，最高可达90.76%。

由表2可知，石韦各溶剂提取物清除DPPH自由基能力大小依次为PL-B>PL-W>PL-E>PL-P，其中PL-B和PL-W清除DPPH 自由基的IC50值较为接近，且显著小于PL-E和PL-P，表明石韦清除DPPH自由基的活性物质主要集中在较大极性的水提取物和正丁醇提取物。

图3 石韦各溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的影响

表2 石韦各溶剂提取物清除DPPH自由基的IC50值

2.2.2 ABTS自由基清除能力

石韦不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除率测定结果见图4、表3。由图4可知，石韦各溶剂提取物清除ABTS自由基能力随质量浓度的增大而增强。当质量浓度为200 μg/mL时，清除率由高到低依次为：PL-B>PL-W>PL-E>PL-P，其中PL-B的清除率高达90.08%，接近于阳性对照Vc(95.67%)。

由表3可知，石韦各溶剂提取物清除ABTS自由基能力具有显著性差异(P<0.05)，清除能力大小依次为PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B清除ABTS自由基的IC50值为97.47±12.10 μg/mL，远远小于其它3个溶剂提取物，表明石韦对ABTS自由基清除的活性物质可有效富集在正丁醇提取物。

图4 石韦各溶剂提取物对ABTS自由基清除能力的影响

表3 石韦各溶剂提取物清除ABTS自由基的IC50值

2.2.3 铁还原能力的测定

石韦不同溶剂提取物对铁还原能力的测定结果见图 5。由图5可知，石韦PL-B的铁还原能力最强(822.08±24.82 μmoL Vc/g)，单因素方差分析和多重比较(Duncan法)结果显示，PL-B的铁还原能力与其它溶剂提取物存在显著性差异(P<0.05)，表明石韦对铁还原能力的活性物质主要集中在正丁醇提取物。

2.3 体外抑制亚硝化活性测定结果

2.3.1 亚硝酸盐的清除能力

石韦不同溶剂提取物对亚硝酸盐的清除率测定结果见图6、表4。由图6可知，在模拟胃酸条件下，石韦各溶剂提取物具有一定的清除亚硝酸盐的能力，随质量浓度增大而增强。

图5 石韦各溶剂提取物对铁还原能力的影响

由表4可知，石韦各溶剂提取物清除亚硝酸盐能力大小依次为PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B清除亚硝酸盐的 IC50值为7.071±0.231 mg/mL，明显小于其余三个溶剂提取物，表明石韦对亚硝酸盐清除的活性物质主要集中在正丁醇提取物。

图6 石韦各溶剂提取物对亚硝酸盐清除能力的影响

表4 石韦各溶剂提取物清除亚硝酸盐的IC50值

2.3.2 亚硝胺合成的阻断能力

石韦不同溶剂提取物对亚硝胺合成的阻断力测定结果见图7、表5。由图7可知，石韦各溶剂提取物具有一定的阻断亚硝胺合成的能力，随质量浓度增大而增强，呈一定的量效关系。其中，PL-B对亚硝胺合成的阻断能力最强，在质量浓度为20.0 mg/mL时，阻断率达65.03%。

由表5可知，石韦各溶剂提取物阻断亚硝胺合成能力大小依次为PL-B>PL-W>PL-E>PL-P。其中PL-B阻断亚硝胺合成的IC50值为15.010±1.224 mg/mL，明显小于其余三个溶剂提取物，表明石韦阻断亚硝胺合成的活性物质主要集中在正丁醇提取物。

图7 石韦各溶剂提取物对亚硝胺合成阻断能力的影响

表5 石韦各溶剂提取物阻断亚硝胺合成的IC50值

2.4 总酚和总黄酮含量与抗氧化活性和抑制亚硝化活性的相关性分析

石韦不同溶剂提取物总酚、总黄酮含量与抗氧化活性和抑制亚硝化活性的相关性结果见表 6。

由表6可知，石韦各溶剂提取物总酚、总黄酮含量与ABTS自由基清除能力、亚硝胺合成的阻断能力呈极显著正相关(P<0.01)，与DPPH自由基清除能力、铁还原能力、亚硝酸盐清除能力呈显著正相关(P<0.05)。表明石韦各溶剂提取物总酚、总黄酮含量与抗氧化活性和抑制亚硝化活性具有显著相关性，其中总酚、总黄酮含量对ABTS自由基清除能力及亚硝胺合成的阻断能力的影响大于DPPH 自由基清除能力、铁还原能力、亚硝酸盐清除能力。

表6 相关性分析结果

注：**双侧极显著相关(P<0.01)，*双侧显著相关(P<0.05)。

Note:**indicates significant correlation at 0.01 level(both sides);*indicates significant correlation at 0.05 level(bilateral).

3 结论与讨论

石韦为常用中药，临床用于膀胱炎、泌尿系结石、尿血的治疗[7]，疗效确切，其资源分布较广，有良好的开发前景，但其发挥活性作用的物质基础尚不明确。

实验以药材石韦为原料，对其总酚、总黄酮含量及其抗氧化和抑制亚硝化活性进行了系统研究。试验结果表明，各提取物均含有总酚、总黄酮，其中正丁醇提取物(PL-B)中总酚、总黄酮的含量较高，并显著高于其他提取物，差异具有统计学意义(P<0.05)。活性研究显示，各提取物均有不同程度的还原力、自由基清除作用以及抑制亚硝化作用，并呈一定的量效关系。从整体上看，正丁醇提取物(PL-B)表现出较强的DPPH、ABTS 自由基清除作用和较强的Fe3+还原作用，且明显强于其他提取物(P<0.05)。与此同时，正丁醇提取物(PL-B)对亚硝化反应有较好的抑制作用，能够清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成，并优于其他提取物，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果提示，石韦抗氧化和抑制亚硝化活性成分主要存在于极性较大的正丁醇提取物中，这可能与其富含黄酮类、酚酸类活性成分有关[19]，学者Mizuno等[20]也从石韦正丁醇提取物中分离得到了绿原酸，且含量丰富，现已为药典规定的石韦指标性成分。相关性分析显示，总酚、总黄酮含量对ABTS自由基清除能力及亚硝胺合成阻断能力呈极显著正相关(P<0.01)，对DPPH 自由基清除能力、铁还原能力、亚硝酸盐清除能力呈显著正相关(P<0.05)。因此，石韦提取物中，石韦正丁醇提取物具有较强的体外抗氧化和抑制亚硝化活性，总酚、总黄酮是其发挥作用的物质基础。石韦正丁醇提取物可用于天然抗氧化剂开发，同时极有可能是一种新的防癌抗癌天然保健品。提示应以ABTS自由基清除和亚硝胺合成阻断能力为活性指标对石韦正丁醇提取物中的总酚和总黄酮进一步分离纯化，明确活性物质基础，并对抗氧化和抑制亚硝化活性成分的构效关系、作用机制、以及活性成分间的协同或拮抗作用等方面开展系统性研究，将有助于阐明石韦药用科学内涵，为开发石韦作为防癌抗癌保健食品和天然抗氧化剂提供参考。