增龄对大鼠心脏组织炎症小体信号通路的改变

刘艳，邢莎莎*，杨进，雷霞，杨雨婷，陈林，王凯

(成都大学附属医院：1药物临床试验中心，2泌尿外科，成都 610081)

心血管疾病是发达国家主要的致死性疾病。随着年龄增加， 心血管疾病的发病率呈显著上升趋势[1]。心脏的老化是一个复杂的病理生理过程，伴随着多种生物学现象的发生，主要表现为心脏舒张

功能紊乱、心脏肥大、纤维化和收缩功能受损[2]。心脏纤维化伴随衰老进程，加速心脏损伤[3]。在衰老的小鼠和人的心脏中，纤维连接蛋白和胶原显著增加，衰老的心肌成纤维细胞纤维化信号和胶原形成显著增加[4]。心脏胶原堆积引起心室过度纤维化，进一步引起心肌硬化，导致了心脏舒张功能障碍[5]。炎性小体作为慢性、低水平、无菌性炎症的主要感受器，在衰老相关心血管疾病中的作用受到广泛关注[6]。但是，在老年大鼠心脏中，缺乏炎症小体活化的直接证据。本研究旨在观察衰老所致大鼠心脏的胶原沉积和炎症小体活化的变化，旨在为衰老导致的心脏组织肥大和炎症提供直接的实验证据。

1 材料与方法

1.1 试剂

半胱天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)抗体、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)抗体购于德国Abcam公司；p16抗体、p21抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购于武汉三鹰生物技术有限公司；苏木素、丽春红、二氨基联苯胺染色液(diaminobenzidine，DAB)染色液购于武汉塞维尔生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物

SD大鼠10只，均为雌性[7]：正常饲养20个月的大鼠作为老年组，正常饲养8周龄的大鼠作为青年组，每组5只。采用异氟烷进行麻醉，取大鼠心脏组织，冰磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，检测相关指标。

1.3 方法

1.3.1 Masson染色 切片经苏木素染细胞核、丽春红染色、磷钼酸处理，苯胺蓝染色，分化，脱水封片。采用Pannoramic MIDI扫描仪行全波长扫描(3D HISTECH，匈牙利)，胶原纤维呈蓝色，观察心脏组织胶原沉积情况。

1.3.2 免疫组织化学染色 切片脱石蜡后，行免疫组织化学染色，具体步骤如下：抗原修复后阻断内源性过氧化物酶，加入牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育后，加入DAB显色。苏木素复染后脱水封片，Pannoramic MIDI扫描仪行全波长扫描。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。浓度为：IL-1β抗体1∶100；p16抗体1∶50；p21抗体1∶50。

1.3.3 免疫荧光染色 切片脱蜡至水、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修复、血清封闭，加一抗4℃孵育过夜，洗涤一抗后，加二抗室温孵育50 min，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染细胞核，封片，切片，于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像(红光激发波长510～560 nm，发射波长590 nm)。

1.4 图像分析

采用Image-pro plus 6.0软件对图像进行分析，每张切片随机选择5个视野进行分析，自动计算光密度值，取平均光密度值用于各组之间比较。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 增龄对大鼠心脏组织肥大和胶原沉积

与青年大鼠相比，老年大鼠的心脏体积显著增大(图1A)。Masson染色结果显示，衰老大鼠心脏组织胶原沉积明显增加[(12.54±2.8)%和(45.12±7.63)%]，提示随着衰老进程，心肌组织胶原沉积，纤维化导致心脏组织肥大(图1B，C)。

2.2 增龄对大鼠p16和p21蛋白表达的影响

与青年组大鼠相比，老年组大鼠心脏组织衰老标志p16[(21.45±5.21)%和(38.71±6.89)%]和p21[(19.23±7.32)%和(41.01±10.21)%]蛋白的表达均显著增加(P<0.05；图2)，提示随着年龄增长，心脏细胞呈现衰老的特性。

2.3 增龄对大鼠心脏组织IL-1β表达的影响

与青年组大鼠相比，老年组大鼠心脏组织炎症标志蛋白IL-1β表达显著增加[(5.27±1.02)%和(14.62±3.87)%]，差异具有统计学意义(P<0.05；图3)，提示随着年龄增长，心脏细胞呈现炎症特性。

2.4 增齡对大鼠心脏组织Caspase-1蛋白表达的影响

随着衰老进程，大鼠心脏组织Caspase-1蛋白表达显著增加[(10.23±7.12)%和(42.01±8.91)%]，差异具有统计学意义(P<0.05；图4)，提示炎症小体活化是诱导心脏组织衰老的关键机制。

3 讨 论

心脏纤维化是指心脏组织内结缔组织增多和实质细胞减少的病理变化，是多种心血管疾病的共同病理特征，纤维化导致的心脏功能衰竭是患者致死和致残的主要原因[8]。衰老是心肌组织纤维化和组织重构的关键风险因子，在增龄相关的高血压、肥厚性心肌病和心肌缺血等心血管疾病中，均存在心脏胶原沉积和纤维化改变[9]。目前对于自然衰老进程中心脏组织重构的机制尚未被阐明。

图1 增龄诱导大鼠心脏组织肥大和胶原沉积

A: representative image for rat heart; B, C: Masson-trichrome staining (scale bar=100 μm) and quantitative analysis of collagen deposition,respectively. Compared with young group,**P<0.01.

图2 2组大鼠p16和p21蛋白表达的比较

图3 2组大鼠IL-1β蛋白表达的比较

A: immunohistochemical staining (scale bar=100 μm); B: quantitative analysis. IL-1β: interleukin-1 beta. Compared with young group,*P<0.05.

图4 2组大鼠Caspase-1蛋白表达的比较

A: immunofluorescence staining (scale bar=100 μm); B: quantitative analysis. Compared with young group,*P<0.05.

衰老机体持续存在低水平、慢性、无菌性炎症，可以通多种作用损害免疫系统活化，因此，调节炎症代谢物可能是干预年龄相关疾病的重要方式[10]。研究表明，炎症小体是慢性、低水平、无菌性炎症的主要感受器。在机体受到外界病原微生物侵袭或自身发出“危险信号”时，NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)或黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)分子被激活，组成蛋白复合体，并招募Pro-Caspase-1，导致其局部高浓度，发生自体水解，随后形成异二聚体，进一步聚合形成四聚体，成为有活性的Caspase-1。Caspase-1剪切无活性的pro-IL-1β，促进其成熟及分泌[11,12]。在衰老相关的心血管疾病中，均发现了炎症小体的活化，但对于自然衰老的心脏中是否存在炎症小体活化尚未见相关报道。

本研究证实，在自然衰老进程中，存在Caspase-1活化和IL-1β炎症介质释放，提示炎症小体活化导致的炎症可能是导致自然衰老的关键机制，抑制炎症小体活化有望成为干预心脏胶原沉积和心脏老化的新靶点。