基于网络药理学探讨黄芪-丹参配伍在糖尿病肾病中的应用

王小龙，亓咏梅，席永宽

（安徽省阜阳市中医医院药剂科，安徽 阜阳236000）

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病常见的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病（ESRD） 的关键因素。我国住院糖尿病患者肾病的并发率达33.6%，约30% 1 型糖尿病和20%～50% 2 型糖尿病患者发生DN［1］。其中年龄、病程、高血糖、高血压、血脂紊乱、高尿酸、吸烟、肥胖等是DN 的相关危险因素［2］。西医对于早期DN的治疗多针对患者血压、血脂、血糖的控制来推迟肾病的出现，后期则以腹膜透析、肾移植为主。虽然临床上取得了一定的疗效，但由于不良反应大，患者依从性相对较差，一定程度上限制了其临床应用。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceuus（Fisch.） Bge.的干燥根。其味甘、性微温，主含黄芪多糖、三萜类、黄酮类等化合物，能调节血糖、降血压、降血脂［3］。《中国药典》 言其主“内热消渴”，一些研究［4-6］也证实了黄芪对于DN 的独特疗效。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，已有研究［7］证实丹参提取物能有效降低早期DN 患者的炎症反应，并改善肾血管内皮功能。黄芪与丹参相使配伍，益气与活血并重，气旺血行，血行气亦旺，共奏益气活血、推陈出新之功，有较好的协同作用，且两药一定比例的配伍优于单味作用［8-9］。黄芪-丹参配伍能通过改善DN 大鼠肾脏线粒体呼吸功能及能量代谢，改善DN 大鼠肾脏的功能，故常联合用于治疗DN，效果显著［10-11］。本研究借助TCMISS 软件及BATMAN-TCM 平台，以DN 相关中药处方为研究对象，从关联规则Apriori 算法及网络药理学切入，探讨黄芪-丹参组合在DN 中的应用规律、作用靶点及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 处方来源 处方来源于张光荣主编的《糖尿病效验秘方》［12］一书，该书收录了DN 古今验方92 首，其中同时出现黄芪-丹参组合的54 首，故将此54 首处方纳入本次研究。《糖尿病效验秘方》 由中国医药科技出版社出版，该书内容丰富、通俗易懂、疗效确切、针对性强，具有一定的代表性。

1.2 数据预处理 数据预处理是数据挖掘中极为重要的一环，针对中药方剂数据挖掘需要一套以数据清洗为主的数据预处理方法，使数据规范、准确和有序，利于后续的挖掘处理［13］。为便于统计、降低数据挖掘结果的偏差，本次研究参考高等院校《中药学》［14］教科书，将药名进行统一化处理。教材中未收录的，参考《常用中药别名速查手册》 一书［15］，其余均使用统一的名称，以确保数据的整齐性即可。

1.3 数据录入 将纳入研究的的92 首处方药物由专人录入“中医传承辅助平台（TCMISS） V2.5” 软件（由中国中医科学院中药研究所提供） 中的“平台管理” →“方剂管理” 模块，建立DN 的方剂数据库。并将相关数据录入BATMAN-TCM （Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM，http： ／ ／bionet.ncpsb.org／batmantcm／） 平台进行药物-成分-疾病-靶点分析。考虑到人工录入可能出现的偏差，完成数据录入后，由另一名研究人员对数据进行逐条审核，以确保数据与原书相符。

1.4 数据提取 进入TCMISS 的“数据分析系统模块”“方剂类别” 下拉框选择“糖尿病肾病”，“指定中药” 输入“黄芪”，点击“查询” 按钮，共搜索出符合条件记录75 条。将“黄芪” 删除，再输入“丹参”，点击“结果中查询” 按钮，则提取出含有黄芪-丹参药组的54 首处方。

1.5 数据分析 采用TCMISS 软件中的“数据分析系统”进行频次统计、关联规则Apriori 分析、组方规律分析。运用BATMAN-TCM 平台进行药物-成分-疾病-靶点分析。完成数据分析后，将数据导出，运用Microsoft Excel 表格对数据进行排序整理。

2 结果

2.1 用药频次分析 在 “数据提取” 的基础上，点击“频次统计”，共出现104 味中药。点击“药频导出”，将每味中药的出现频次进行求和，共计607 味次。频次由高到低的前五味为黄芪、丹参、茯苓、山药、益母草，出现频次均≥26 次。用药频次≥10 的见表1。药物功效分类见图1、表2。

表1 出现频次≥10 的药物

图1 频次≥2 的药物一级功效分类

2.2 基于关联规则Apriori 算法分析 点击“组方规律” 按钮，根据高频药物组合数量，通过将支持度个数设置为19，共出现30 条药物组合模式，其中包含9 味中药。见表3。

支持度个数为19 条件下，通过进一步将置信度设置为0.8，点击“规则分析”，共出现包含6 味中药的27 条关联规则。通过进一步整理，将此27 条关联规则展示如下，见表4。进一步进行药物之间的网络图展示，见图2。通过设置不同的支持度，显示核心药物与外围药物之间不同的配伍规则，见图3～4。

表2 频次≥2 的药物二级功效分类

表3 支持度个数为15 条件下的高频药物组合模式

表4 Apriori 算法的药物关联规则分析

图2 支持度个数19，置信度0.8 条件下药物关系网络图

图3 支持度个数10，置信度0.8 条件下药物关系网络图

图4 支持度个数6，置信度0.8 条件下药物关系网络图

2.3 黄芪-丹参组合的网络药理学分析 将黄芪-丹参组合录入BATMAN-TCM 平台进行网络药理学分析，Score cutoff 调至30，Adjusted P_ value cutoff 调至0.05，共搜集到相关化合物192 个，其中83 个未发现化合物结构信息，故其余的109 个化合物可进行靶点、疾病、信号通路预测。信号通路、GO 功能、相关疾病的富集分析结果见表5～7。进一步将成分-靶点-信号通路-疾病进行网络图展示，见图5。

表5 KEGG 信号通路分析

表6 GO 功能富集分析

表7 相关疾病富集分析

3 讨论

3.1 黄芪-丹参配伍的高频药物分析 本次研究的54 首处方 中，除黄芪、丹参以 外，茯 苓 （57.41%）、山 药（53.70%）、益母草（48.15%） 使用频次亦较高，均在26味次以上。且高频药物功效主要集中在补虚、活血化瘀、清热、利水渗湿、收涩等，频次均≥42 次。通过进一步将高频药物进行二级功效分类，发现高频药物以补气、活血调经、利水消肿、清热凉血、补血、补阴、固精缩尿止带药为主。其中补气药与活血调经药显著高于其他药物，与黄芪-丹参的配伍功效相符。

图5 化合物-靶点-信号通路-疾病网络图

3.2 黄芪-丹参配伍的高频药物关联规则分析 支持度个数是指药物组合在所选处方中出现的频次；置信度表示当A 药出现时，B 药出现的概率，其关系用符号“-＞” 表示。支持度个数与置信度均可根据实际情况进行调节［16］。本次研究根据高频药物组合的数量，首先将支持度设置为19，出现了30 条药物组合模式，其中包含了9 味中药。进一步限制置信度为0.8，出现了6 味节点中药，以黄芪-丹参为核心组成了27 条关联规则，均体现了围绕脾、肾两脏的补气、滋阴、化瘀为主的糖尿病肾病［17］治疗法则。通过调整不同的支持度个数，可以从网络图中直观地看出以黄芪-丹参为核心的外围药物组合模式。支持度个数较低时，基本能反映出围绕黄芪-丹参的核心组合；随着支持度个数的升高，药物数量增加，可以较全面的显示出药物组合的临床使用情况［18］。当支持度个数为19 时，出现了围绕黄芪-丹参组合的山药、川芎、茯苓、益母草、生地黄、当归、山茱萸7 个外围中药。支持度个数调整为10 时，则增加了熟地黄、水蛭、苍术等外围药物。进一步降低支持度个数，则较为全面地反映出以黄芪-丹参为核心的药物组合模式，体现了以补气健脾、滋阴生津、利水渗湿、活血化瘀的治则治法，反证了DN 脾气虚弱、脾肾两虚，阴虚燥热、本虚标实的病因病机［19］。

3.3 黄芪-丹参组合的网络药理学分析本次研究的黄芪-丹参配伍组合中，共有109 个化合物，进一步分析显示有29 条KEGG 信号通路及60 条GO 功能显著富集。而嘌呤代谢、钙信号途径、肾素-血管紧张素系统、炎症免疫介质、以及线粒体凋亡途径等均参与了DN 的发病［20-22］。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS） 是一种与血管密切相关的内分泌系统，在糖尿病肾病发病机制有着极其重要的作用，局部AngⅡ的增多可以通过增加肾小球出球小动脉的压力，并抑制足突细胞去氧肾上腺素的表达，加上糖尿病患者的高血糖状态晚期糖基化终末产物（AGEs） 的形成和排泄增多，导致尿蛋白的超滤过，进而加重足细胞的损伤，并进一步激活RAAS，造成恶性循环，从而引起持续性蛋白尿、肾小球硬化及进行性肾功能恶化［23-25］。此外，线粒体功能紊乱可引起慢性微炎症状态、基质降解及血管内皮的纤维化，而发生机制均有Ca2+通道的异常调控的参与，其机制可能为Ca2+通过激活一氧化氮合酶活性，上调一氧化氮水平，抑制呼吸链中复合体Ⅳ活性，增加活性氧类含有量，而活性氧类大量积聚以及细胞钙调节紊乱的出现，加剧细胞坏死，导致机体损伤与修复并行，加重DN 血管病变［26-28］。另一方面，在DN 的发生发展中，TNF-α、MCP-1、IL-6、ICAM-1 等炎性细胞因子也起着重要作用，炎症因子表达增多可促进炎性巨噬细胞的浸润，最终导致肾小球基膜产生增多，加速肾小球硬化进程，从而加快DN 的病情进展［29-30］。“邪气盛则实，精气夺则虚《素问·通评虚实论》”，RAAS 系统、线粒体功能紊乱，以及致炎因子表达的增多等均密切参与了DN 患者“本虚” “邪实” 的病理进程，反映了DN 多途径、多环节、虚实相兼的发病特点。基于DN “阴虚燥热，本虚标实” 的病因病机，黄芪-丹参一补一泻相使为伍，其极有可能通过调节钙信号途径进而影响线粒体凋亡，同时影响肾素-血管紧张素系统、以及炎症免疫介质的表达而发挥气血同治、补泻兼施的治疗特色。TTD／OMIM 中靶点≥2 的相关疾病富集分析结果显示，如高血压病、神经症、肾脏疾病、肥胖、缺血性脑中风等，这些大多是糖尿病或DN 的常见并发症或伴随症状，而以黄芪-丹参配伍的组合或可成为这些疾病的潜在治疗药物，值得进一步深入研究。

综上所述，本次研究搜集了54 首含有黄芪-丹参组合治疗DN 的处方，借助TCMISS 的关联规则Apriori 算法，得出黄芪、丹参、茯苓、山药、益母草为治疗DN 的高频药物。通过设置不同的支持度个数，进一步挖掘出由少至多、由核心到外围的黄芪-丹参相关组合模式。这些组合基本反映了DN 的病因病机和治则治法。进一步借助网络药理学研究方法，从微观层面探讨了黄芪-丹参组合治疗DN的作用靶点和作用机制。然而由于本次研究的样本量相对较少，难以较全面体现该病的治疗用药规律，有待于进一步的临床及实验验证。