白藜芦醇对代谢综合征大鼠糖脂代谢的改善作用

缪 萍，周 飞，王邦才，张 斌

（1.宁波市鄞州人民医院，浙江 宁波315040； 2.宁波大学医学院，浙江 宁波315211； 3.宁波市中医院，浙江 宁波315010）

代谢综合征（metabolic syndrome，MS） 是以中心性（腹型） 肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病或糖耐量受损等多种代谢性疾病聚集出现为特点的一组临床症候群［1］，以胰岛素抵抗（insulin resistance，IR） 为共同病理基础［2］，已成为全球公共健康主要问题。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK） 是一种细胞和机体的“能量调节器”，被激活的AMPK 有助于纠正代谢紊乱，使之趋向生理平衡，成为治疗多种代谢性疾病的新靶点［3］。白藜芦醇（resveratrol，Res） 是一种非黄酮类多酚化合物，广泛分布于虎杖、葡萄、花生等多种植物中，具有降脂、保肝、抗炎、抗氧化及调节免疫等药理活性［4］。本研究拟采用高脂高盐高糖饮食诱导大鼠MS 模型，围绕AMPK 信号传导通路的关键环节，探讨白藜芦醇改善糖脂代谢的可能作用机制。

1 材料

1.1 动 物 SPF级雄性SD大鼠32只，体质量（200±20） g，购自浙江省医学科学院实验动物中心，生产许可证号SCXK （浙） 2014-0001，饲养于宁波大学实验动物中心，自由进食饮水。

1.2 药物与试剂 白藜芦醇 （纯度为99.88%，批号FY10700805） 购自江苏南通飞宇生物科技有限公司，用纯水配制成质量浓度为20 mg／mL 的混悬液；盐酸二甲双胍片（国药准字H20023370） 购自中美上海施贵宝制药有限分司，使用前用蒸馏水配成质量浓度为30 mg／mL 的溶液，以上药液均置于4 ℃冰箱保存。高脂高盐高糖饲料购自北京科澳协 力饲料 有限公 司；空腹血 糖 （FPG，批 号151041-01）、空腹胰岛素（FINS，批号21587103）、总胆固醇 （TC，批 号 2175701）、甘油三 酯 （TG，批 号22259201）、高密度脂蛋白（HDL-C，批号621827-01）、低密度脂蛋白（LDL-C，批号618989-01） 试剂盒购自瑞士罗氏公司；RNA 抽提试剂盒（批号1701G14） 购自上海捷瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒（批号7E092G6）、荧光定量PCR 试剂盒（批号7E092H6） 均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型，批号P0010S）、RIPA裂解液（批号P0013B） 均购自江苏碧云天生物技术研究所；乙酰辅酶A 羧化酶（ACC，批号4190S） 抗体购自美国CST 公司；脂肪酸合成酶（Fas，批号SC1023） 抗体购自美国Santa 公司。

1.3 仪器 BW-NIBP1106 型无创血压测量系统（上海软隆科技发展有限公司）；C501 全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）；SMA 4000 微量紫外分光光度计（美国Merinton公司）；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Spectra Max Plus 384 酶标仪 （美国Molecular Devices 公司）；CFX connect 荧光定量PCR 仪、Mini-Proten Tetra System 电泳系统、ChemiDoc XRS 凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad 公司；Avanti J-E多用途高效离心机（美国Beckman 公司）；XS-105电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；超低温冰箱（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模 采用高脂高盐高糖饲料（基础饲料56%+猪油15%+蔗糖15%+蛋黄10% +食盐2% +胆固醇2%） 喂养16周建立MS 模型。

2.2 分组、给药 大鼠适应性饲养7 d 后，按随机数字表法分为正常组、模型组、白藜芦醇组、二甲双胍组，每组8 只。参考文献 ［5］，制定白 藜芦醇 给药剂量为100 mg／kg，二甲双胍根据成人临床日用量，按体表面积折算动物有效剂量，给药剂量为150 mg／kg，正常组和模型组给予蒸馏水，给药体积为5 mL／kg，1 次／d，连续4 周。每天观察大鼠的一般情况（精神状态、活动、进食量和皮毛等），每周测定体质量。

2.3 取样 末次给药后，禁食不禁水12 h，腹腔注射25%乌拉坦（4 mL／kg） 麻醉，腹主动脉取血，3 000 r／min离心20 min，分离血清，-70 ℃保存备用。分离肠系膜、双侧附睾旁和肾周脂肪组织，预冷生理盐水洗净，滤纸吸干，称定质量，并记录。剪取肝脏左叶相同部位组织，-70 ℃冻存待检。计算体脂比＝ （腹腔脂肪质量／体质量） ×100%。

2.4 血压测定 大鼠安静状态下监测尾动脉血压，平行测量3 次，取平均 值，记录收缩压 （SBP） 和舒张 压（DBP），每周测量1 次。

2.5 血清指标检测 按试剂盒说明书检测血清FPG、FINS、TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。计算胰岛素抵抗指数 （HOMA-IR） ＝ ［FPG （mmol／L） × FINS （mIU／L）］ ／22.5。

2.6 qRT-PCR 法检测肝 脏AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表达 TRIzol 法提取总RNA。逆转录合成cDNA，反应条 件为50 ℃、15 min，85 ℃、2 min。引物序 列，AMPKα正 向 5′-CAA CAAGCCCACCCGATTC-3′，反 向5′-TGC CACTTTGCCTTCCGT-3′，163 bp；ChREBP正 向5′-GCAACTGAGGGATGA AATAGAGG-3′，反向5′-TCAAA TAAAGGTCGGATGAGGA-3′ （R），195 bp；SREBP-1 正向5′-TTGAGGATAACCAGGTGAAAGC-3′，反向5′-TCAGAGGGAGTG AGGATGCC -3′，154 bp；β-actin正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TCAGAG GGAGTGAGGATGCC-3′，150 bp。扩增反应程序为95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 个循环。结束后进入融解曲线采集程序，从70 ℃开始每5 s 将温度提高0.5 ℃并采集荧光信号，直至温度达到95 ℃。以β-actin为内参，采用Livak（2-△△ct） 法进行相对基因表达分析。

2.7 Western blot 法检测肝脏ACCα、Fas 蛋白表达 用RIPA 裂解液提取肝脏组织蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取30 μg 样品，SDS-PAGE 电泳，PVDF 转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液摇床洗膜后加二抗（1 ∶5 000），室温孵育1 h，TBST缓冲液反复洗后，ECL 发光显色，凝胶成像仪曝光成像。Image J 软件分析条带灰度值，并进行半定量分析处理。

2.8 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般状态 正常组活动敏捷、反应灵敏、毛发光泽、体质量逐渐增加、大便呈颗粒状，模型组动作迟缓、反应迟钝、皮毛蓬乱、光泽度变差、后期出现脱毛、大便质软、饮水量增多、体质量增加（P＜0.01）、腹腔脂肪堆积（P＜0.01）、体脂比升高（P＜0.01）。给药组状态较模型组有所改善，体质量、腹腔脂肪质量及体脂比均下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量、腹腔脂肪质量及体脂比比较（， n＝8）

表1 各组大鼠体质量、腹腔脂肪质量及体脂比比较（， n＝8）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

3.2 大鼠血压 与正常组比较，模型组大鼠血压SBP、DBP 升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇、二甲双胍均能降低SBP、DBP （P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

3.3 大鼠血糖及胰岛素 与正常组比较，模型组大鼠血清FPG、FINS 水平及HOMA-IR 升高（P＜0.01），与模型组比较，白藜芦醇组、二甲双胍组上述指标均降低（P＜0.01）。见表3。

3.4 大鼠血脂 与正常组比较，模型组大鼠血清TC、LDL-C 水平升 高，而 HDL-C 水平降 低 （P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇在一定程度上改善脂质异常，主要是降低LDL-C 水平，提高HDL-C 水平（P＜0.05），但对TC 影响不大。见表4。

表2 各组大鼠血压比较（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

表2 各组大鼠血压比较（1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）

注： 与正常 组比较，∗∗ P ＜ 0.01；与模型 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.5 大鼠肝 脏AMPKα、ChREBP、SREBP-1 mRNA 表达 与正常组相比，模型组大鼠肝组织AMPKαmRNA 表达降低 （P＜0.01），ChREBP、SREBP-1 mRNA 表达增 加（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组、二甲双胍组均能上调AMPKαmRNA 表 达 （P＜0.05，P＜0.01），降 低ChREBP、SREBP-1 mRNA 表达（P＜0.01）。见图1。

表3 各组大鼠血糖及胰岛素水平比较（， n＝8）

表3 各组大鼠血糖及胰岛素水平比较（， n＝8）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与白藜芦醇组比较，#P＜0.05。

表4 各组大鼠血脂水平比较（mmol／L，， n＝8）

表4 各组大鼠血脂水平比较（mmol／L，， n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

图1 各组大鼠肝组织AMPKα、 ChREBP、 SREBP-1 mRNA 表达比较（n＝5）

3.6 大鼠肝脏ACCα、Fas 蛋白表达 与正常组比较，模型组大鼠肝脏ACCα、Fas 蛋白表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组、二甲双胍组均能抑制ACCα、Fas蛋白表达（P＜0.05）。见图2。

4 讨论

图2 各组大鼠肝组织ACCα、Fas 蛋白表达比较（n＝8）

本实验采用高脂高盐高糖饲料喂养构建MS 模型，旨在模拟人类营养性肥胖代谢紊乱的自然病理过程。研究结果提示，该模型具有腹型肥胖、高血压、血糖血脂异常、高胰岛素血症等特征。经白藜芦醇干预后，能有效控制体质量和血压，明显降 低血清FBG、FINS、HOMA-IR、LDL-C水平，提高HDL-C 水平，改善IR，使机体的糖脂代谢趋于正常。

MS 的发病涉及IR、糖脂代谢、氧化应激和炎症反应等多个机制，且各机制之间相互影响、相互促进。近年来研究［3］表明，AMPK 信号通路转导异常引起糖脂代谢紊乱是MS 发生发展的重要环节。AMPK 是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，由催化亚单位α 和调节亚单位β、γ 组成，广泛存在于骨骼肌、肝脏、胰腺和脂肪组织中。其最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP／ATP 比值的变化进行调节，控制产能的分解与合成代谢通路，保证细胞能量的供应。国外学者研究［6］证实，在食物摄入量相同的情况下，与正常组相比，AMPKα2 基因敲除小鼠的体质量和脂肪组织含有量均增加。当应激反应（如局部缺氧缺血、运动、饥饿和热休克等） 发生时，细胞感受到能量危机，通过ATP 产生减少或利用增加，使细胞内AMP／ATP 的比值上升，从而激活AMPK。被活化的AMPK 通过多条信号通路对机体糖脂代谢发挥着重要的调控作用，主要通过磷酸化抑制ACC 活性，从而抑制脂肪酸的合成，并增强线粒体对脂肪酸的利用和氧化［7］；同时激活的AMPK作为SREBP-1 的上游激酶，可抑制其转录，阻断脂肪酸和TG 合成相关酶的表达［8］；诱导葡萄糖转运蛋白（GLUT-4）表达，促进外周组织葡萄糖的摄取，增加胰岛素敏感性［9］。

SREBPs 是调控脂质合成的重要转录因子家族［10］，它有3 种形式的异构体（SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2）。其中SREBP-1 主要参与脂肪酸和TG 的合成，能够促进脂肪酸从头合成途径中的关键酶ACCα、Fas 的表达。若SREBP-1 过度表达，将导致脂质在肝脏、血管和胰岛等非脂肪组织中异常积聚，从而诱发肥胖、2 型糖尿病和脂肪肝等代谢类疾病［11］。ChREBP 是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLH／ZIP） 转录因子Mondo 家族成员［12］，它的靶标主要是与糖酵解、糖异生和脂质生成相关的酶类，包括肝丙酮酸激酶（LPK）、磷酸果糖激酶 （PFK）、ACC 和Fas 等，在机体脂质代谢和葡萄糖稳态的调控中发挥关键作用。SREBP-1 和ChREBP 协同发挥作用，调节脂质合成相关酶（如ACC、Fas、SCD1） 的表达。

研究［13］发现，针对AMPK 靶点的药物有助于MS 的预防和治疗。临床上常用的二甲双胍是AMPK 激活剂［14］，可改善2 型糖尿病KKAy 小鼠糖耐量异常，促进胰岛β 细胞分泌，减轻肝脏脂肪沉积［15-16］。本研究结果显示，与模型组比较，白藜芦醇同样能明显提高MS 大鼠肝脏AMPKα 活性，降低下游靶分子ChREBP、SREBP-1 mRNA 和ACCα、Fas 的蛋白表达，进而改善脂质和糖代谢失衡，延缓MS 的发展进程。