反相色谱法检测利伐沙班片异构体含量

徐开祥 刘志强 任亚东 孙秋艳

（1.扬子江药业集团有限公司，江苏 泰州 225321；2.扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司，广东 广州510663）

利伐沙班(Rivaroxaban)是新型抗凝药物可以高选择、直接抑制结合或游离状态的Xa 因子，进而中断内、外源性的凝血途径，抑制凝血酶产生，并最终抑制血栓形成[1]。老年非瓣膜性心房颤动患者采用利伐沙班抗凝治疗的有效性及安全性较华法林高，更能有效降低患者的出血事件、不良反应发生率，值得推广[2]。适应症为：用于择期髋关节或膝关节置换手术成年患者，以预防静脉血栓形成(VTE)。用于治疗成人静脉血栓形成(DVT)，降低急性 DVT 后 DVT 复发和肺栓塞（PE）的风险。用于具有一种或多种危险因素（例如：充血性心力衰竭、高血压、年龄≥75岁、糖尿病、卒中或短暂性脑缺血发作病史）的非瓣膜性房颤成年患者，以降低卒中和全身性栓塞的风险。本文采用反相色谱法建立了利伐沙班片异构体含量检测方法。

1 试药与仪器

1.1 试药

利伐沙班对照品，来源于USP，利伐沙班片及空白辅料片，由扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司提供；乙腈（色谱纯）、水（纯化水）。

1.2 仪器

高效液相色谱仪型号为Agilent 1260，电子天平型号为梅特勒XS250

2 异构体测定方法

2.1 色谱条件

采用高效液相色谱法，以CHIRALPAK IC（4.6*250mm 5μm）为色谱柱，以乙腈为流动相；检测波长为250nm，柱温为25℃，流速为1.0mL∕min。

2.2 样品配制

系统适用性试验溶液：取利伐沙班异构体对照品约6mg，精密称定，置250ml 量瓶中，用稀释剂（乙腈:水=50:50）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为利伐沙班异构体储备液；另取利伐沙班对照品约15mg，精密称定，置10ml 量瓶中，精密加入利伐沙班异构体储备液1ml，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml 中约含利伐沙班异构体2.4μg、利伐沙班1.5mg 的混合溶液，作为系统适用性溶液。

供试品溶液：取本品细粉约640mg（约相当于利伐沙班75mg），精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂适量，超声30min使溶解并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得每1ml 中约含利伐沙班1.5mg的供试品溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液5ml，置100ml 量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液；精密量取对照储备液3ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

图1 空白辅料色谱图

图2 利伐沙班异构体色谱图

灵敏度溶液：精密量取对照储备液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液

2.3 异构体测定

系统适用性溶液中，利伐沙班异构体和利伐沙班的分离度应不小于1.5；灵敏度溶液中，主峰的信噪比应不小于10。

样品测定：进样体积为20μL，按自身对照法计算本品异构体含量。

3 方法学研究

3.1 专属性试验

称取空白辅料粉末约640mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂适量，超声30min 使溶解并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。以稀释剂[乙腈:水=50:50]为空白溶剂；分别采集空白溶剂、空白辅料溶液、供试品溶液、对照溶液的图谱。图谱见下图1～图3，空白辅料溶液在供试品、对照品溶液的主峰位置无干扰峰，即辅料对异构体测定无干扰。

3.2 检测限和定量限

取对照品溶液，稀释后进样，信噪比为10:1时为定量限，信噪比为3:1 时为检测限，检测限浓度为0.10201μg∕ml，检测量为2.04ng，约相当于供试品浓度0.007%；定量限浓度为0.34004g∕ml，约相当于供试品浓度0.023%

3.3 线性与范围

取利伐沙班异构体对照品，配制成浓度分别为0.34μg∕mL、1.13μg∕mL、1.81μg∕mL、2.27μg∕mL、3.40μg∕mL、4.53μg∕mL 的利伐沙班异构体溶液，进样，收集峰面积数据，结果见表1。

表1 线性结果

图3 利伐沙班色谱图

以利伐沙班异构体浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行拟合，结果显示，利伐沙班异构体在0.34μg∕ml～4.53μg∕ml 的浓度范围内，与峰面积的响应值线性相关，线性方程为y=71.2240x-0.6779，相关系数为r=0.99998。

3.4 准确度

按50%、100%、120%三个浓度水平，称取利伐沙班异构体加入到供试品溶液中，配置方法同供试品溶液配制方法，采用本方法进行检测，计算加样回收率，结果见表2。

表2 准确度测定结果

结果显示，在50%、100%、120%三个浓度水平下，平均回收率为101.2%，RSD 为0.6%（n=9），结果符合要求，说明方法具有良好的准确度。

3.5 重复性

取同一批次，配置6份样品，分别进样检测，结果显示，6份样品的测定结果均在0.032%～0.035%之间，RSD为3.2%（n=6），异构体测定方法的重复性较好。

3.6 溶液稳定性

取供试品溶液 1 份，分别于配样后 4h、8h、12h、16h、20h、24h进样，统计异构体含量，结果见表3。结果显示，样品溶液在24h内稳定。

表3 溶液稳定性测定结果

3.7 耐用性试验

取系统适用性试验溶液、灵敏度溶液、对照溶液和供试品溶液，对色谱条件中的波长、流速、柱温进行变动，从分离度、灵敏度信噪比、异构体含量结果各方面来考察该方法的耐用性，结果见表6。

表4 耐用性试验结果

从表格数据可以看出，改变波长、流速、柱温，系统适用性均符合要求，对异构体检测结果影响不大，该方法耐用性良好。

4 讨论

4.1 检测波长的选择

利伐沙班的最大吸收波长为250nm，故选择250nm 作为利伐沙班的检测波长。

4.2 溶剂的选择

崔萍等[3]建立了异构体检测方法，使用研创IB 手性柱，流动相为正己烷(含0.1%三氟乙酸):异丙醇:乙醇(60∶20∶20)；张倩如等[4]也建立了异构体检测方法，方法为色谱柱为Chiralpak IA(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml∕min，检测波长为250nm，柱温为40℃。上述方法均针对本品种原料药建立检测方法，使用均为正相色谱法，正相色谱法存在液相切换复杂，灵敏度较低。本品制剂中存在大量的辅料，辅料在有机溶剂存在溶解性问题，需要水参与来溶解片剂辅料，但正相系统不能兼容水，可能会损坏正相色谱柱。因此在方法建立上，建立了反相色谱法来兼容

5 结语

本方法测定结果准确，精密度高，耐用性良好，可以作为利伐沙班片中异构体含量测定方法。