颗粒细胞Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达与PCOS患者脂代谢及胚胎质量的相关性

杨珖，姚桂东，孙莹璞

(郑州大学第一附属医院 生殖医学中心，河南 郑州 450052)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女最常见的生殖内分泌疾病之一，全世界的发病率达6%～26%[1]，常伴有生殖系统、代谢系统和心理的异常。PCOS的症状和体征可始于青春期，包括月经不调、雄激素过多、肥胖、胰岛素抵抗和血清黄体生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高等。由于多数PCOS患者无排卵或稀发排卵，因此，PCOS是影响女性卵巢功能并可导致不孕的重要因素。此外，研究表明，有PCOS的女性患者不仅发生2型糖尿病的风险增加[2]，还有多种心血管疾病相关的高危因素[3]。PCOS的病理生理学非常复杂，遗传和环境因素目前被认为与疾病的发生密切有关，但确切的发病机制尚不清楚。考虑到PCOS的长期不利后果，及早诊治显得尤为重要。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200 nt且无蛋白质编码功能的一类RNA分子。前研究发现，LncRNA可在多个水平调控基因的表达和蛋白功能的发挥，广泛参与许多病理和生理过程：其可通过与转录因子结合调控下游靶基因的表达；可通过与调节蛋白结合形成核酸蛋白质复合体，影响下游蛋白的功能发挥等[4-5]。近年来，LncRNA已成为多个领域的研究热点。

目前已发现多种LncRNA参与调控PCOS的病理生理变化[6-8]。Lnc-ADAMTS1-1∶1位于人21号染色体，是与卵巢功能密切相关的新型LncRNA[9]，其与PCOS的疾病相关性尚无报道。本研究通过探讨Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS发生中的重要作用，为PCOS的诊断和治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 样本收集本研究收集2018年8月至2019年1月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心接受体外受精(invitrofertilization，IVF)治疗的不孕患者，共59例，其中PCOS患者35例。其诊断基于2003年鹿特丹标准，即满足以下3个临床特征中的2个或2个以上：月经失调(月经稀发或闭经)；有雄激素过多的临床表现或高雄激素血症；超声检测下可见多囊卵巢(双侧卵巢内2～9 mm的卵泡大于12个，或卵巢体积>10 cm3)。另有24例排卵周期正常的女性作为对照组(因男性不育或/和输卵管因素不孕而接受辅助生殖技术治疗)。对照组患者均无高雄激素血症的临床或生化特征，或与PCOS相关的其他内分泌疾病。此外，有系统性疾病、甲状腺功能异常、子宫内膜异位症、泌乳素水平异常或卵巢手术史的女性被排除在本研究外。

患者的临床和实验室数据来自本中心生殖管理系统。收集患者体质量指数(body mass index，BMI)、抗穆勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)和血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，评估健康状况。月经来潮第2～3天测定患者基础内分泌水平，包括孕酮(progesterone，P)、睾酮(testosterone，T)、泌乳素(prolactin，PRL)、雌二醇(estradio，E2)、卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(lutein hormone，LH)。周期促性腺激素(gonadotropin，Gn)总量为该周期促排卵治疗时注射Gn的总量。

IVF实验室指标：卵母细胞成熟率=MⅡ卵母细胞数/获卵数，受精率=受精数/获卵数，卵裂率=卵裂胚胎总数/受精数，优胚率=优质胚胎数/受精数，囊胚形成率=囊胚数/囊胚培养数。此外，由2位胚胎学家根据peter胚胎评分系统[10]评价胚胎质量。优质胚胎指Ⅰ级和Ⅱ级的胚胎。

本研究通过郑州大学第一附属医院生物医学伦理委员会批准(2018-KY-65)。研究对象均签署知情同意书。

1.2 细胞培养根据先前研究中提取颗粒细胞的方法[11]，在患者行卵巢穿刺取卵术当天获得卵泡液，并通过密度梯度离心法纯化原代颗粒细胞。将纯化的原代颗粒细胞冻于液氮中，待随后提取细胞总RNA使用。

1.3 实时PCR使用TRIZOL法(Invitrogen，美国)裂解细胞并提取细胞内总RNA，使用Nanodrop(Thermofisher Science，美国)测量样品的RNA浓度。根据浓度计算反转录系统中所需的RNA量，使用反转录试剂盒(Bio-Rad Laboratories，美国)将RNA反转录为cDNA。使用5×SYBR Green supermix(Bio-Rad Laboratories)在Bio-Rad 7500实时PCR系统上进行实时PCR反应。PCR检测时所用Lnc-ADAMTS1-1∶1的引物序列为：CAGAGTGAGCAACATCGCAG，TCTTCCAGCGCAAAGTTGGA；GAPDH的引物序列为GACAGTCAGCCGCATCTTCT，GCGCCCAATACGACCAAATC。GAPDH为内参基因，通过2-△△Ct法计算靶基因相对于内参的相对表达倍数。

2 结果

2.1 临床数据总结两组患者的年龄、P、PRL、E2、TC、周期Gn使用总量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；PCOS组患者BMI、AMH、LH、T、TG、LDL高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PCOS组患者FSH和HDL水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 IVF实验室数据总结对照组获卵数为(15.17±1.25)个，PCOS组获卵数为(16.20±1.00)个，差异无统计学意义(t=0.650，P>0.05)。两组卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；PCOS组患者优胚率和囊胚形成率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 两组患者一般资料和临床指标比较

注：BMI—体质量指数；AMH—抗穆勒激素；FSH—卵泡刺激素；LH—黄体生成素；E2—雌二醇；T—睾酮；P—孕酮；PRL—催乳素；Gn—促性腺激素，TG—甘油三酯；TC—总胆固醇；HDL—高密度脂蛋白；LDL—低密度脂蛋白。

表2 两组患者IVF实验室指标比较(%)

2.3 Lnc-ADAMTS1-1∶1在颗粒细胞中的表达PCOS组颗粒细胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的相对表达量(3.74±0.35)高于对照组(1.78±0.31)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：a代表P<0.001。

图1Lnc-ADAMTS1-1∶1在两组患者颗粒细胞中的表达

2.4 颗粒细胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达与患者临床指标及IVF实验室指标的相关性对照组Lnc-ADAMTS1-1∶1与BMI呈显著正相关(r=0.543，P=0.006)；PCOS组Lnc-ADAMTS1-1∶1与血清PRL水平呈正相关(r=0.361，P=0.033)，与血清TC水平(r=-0.431，P=0.010)和LDL水平(r=-0.384，P=0.023)呈负相关。Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达与优胚率呈显著正相关(r=0.413，P=0.026)。见表3、4。

表3 两组患者颗粒细胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达与临床指标的相关性

注：BMI—体质量指数；AMH—抗穆勒激素；FSH—卵泡刺激素；LH—黄体生成素；E2—雌二醇；T—睾酮；P—孕酮；PRL—催乳素；Gn—促性腺激素，TG—甘油三酯；TC—总胆固醇；HDL—高密度脂蛋白；LDL—低密度脂蛋白。

表4 两组患者颗粒细胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达与IVF实验室指标的相关性

2.5 Lnc-ADAMTS1-1∶1对PCOS的诊断意义曲线下面积为0.851(95%置信区间：0.744～0.958)，且Lnc-ADAMTS1-1∶1/GAPDH的截断值为1.909时灵敏度为0.881，特异性为0.760。见图2。

图2 颗粒细胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达水平诊断PCOS的ROC曲线

3 讨论

近年来，LncRNA参与PCOS的内分泌和卵巢功能的调控成为了研究的热点。雄激素反应性CTBP1-AS在PCOS患者中表达升高[12]，可能通过调节雄激素受体的活性，进而影响PCOS患者高雄激素的临床表型[13]；BANCR可能通过影响Bax和p53的表达促进PCOS患者颗粒细胞的凋亡[7]；小鼠中沉默SRA可明显缓解PCOS的表型，且可抑制脱氢表雄酮暴露下卵巢颗粒细胞中肿瘤坏死因子-α的产生和核转录因子-κB的激活[6]。有关LncRNA参与女性生殖功能的调控研究仍处于早期阶段，目前仍需要深入地进行。Lnc-ADAMTS1-1∶1是一种新型LncRNA[9]，其与卵巢疾病相关的研究尚无几例。本研究发现Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS患者颗粒细胞中显著高表达，且与患者脂代谢水平以及IVF胚胎质量有显著相关性。

研究表明，PCOS患者的血清TG、TC、LDL水平高于对照组，HDL水平明显降低[14]，且由于脂代谢异常，并发2型糖尿病与心血管疾病的风险居高[2-3]。本研究结果也提示PCOS患者存在明显的血脂代谢异常。本研究显示，PCOS患者Lnc-ADAMTS1-1∶1的表达水平与TC和LDL呈显著负相关，与HDL呈正相关。因此，推测Lnc-ADAMTS1-1∶1可能作为一种保护因子对PCOS患者血脂代谢的异常起抑制作用，这可能成为改善PCOS血脂异常的新策略。

本研究显示，Lnc-ADAMTS1-1∶1与PCOS患者IVF优胚率呈显著正相关。根据之前的研究，Lnc-ADAMTS1-1∶1在卵巢早衰患者的卵巢中显著差异表达，提示其与卵巢功能密切相关[9]。Yao等[9]研究还表明，Lnc-ADAMTS1-1∶1在ADAMTS1基因的5’端，在卵巢组织中与ADAMTS1的表达呈显著正相关，且生物信息学分析结果提示，ADAMTS1是Lnc-ADAMTS1-1∶1的潜在靶基因。ADAMTS1属于ADAMTS家族成员，是一种新型金属蛋白酶[15]。在卵巢中，ADAMTS1可促进卵母细胞的成熟，并在排卵时裂解多功能蛋白聚糖等细胞外基质，影响卵丘卵母细胞复合体的扩张，确保排卵的顺利发生[16-17]。而ADAMTS1与PCOS的发生发展也密切相关，在PCOS患者来源的卵巢、颗粒细胞、卵泡液样本中均显著性差异表达，且对PCOS患者IVF结局有着很好的预测作用[18-20]。研究表明，行IVF治疗的PCOS患者由于卵泡发育微环境的异常而面临卵子和胚胎质量的下降，导致助孕结局的失败[21]。基于此，Lnc-ADAMTS1-1∶1可否通过调控ADAMTS1改善PCOS患者IVF卵子质量和胚胎发育结局等科学问题值得深入研究。

本研究明确了Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS患者颗粒细胞中的表达趋势，同时发现其对PCOS患者脂代谢和IVF胚胎质量的显著相关性，这为更进一步地了解LncRNA在PCOS发病进程中的作用以及更深入地理解PCOS患者代谢状态和卵泡发育微环境提供了新的线索。但本次实验例数较少，在未来的研究中可增多样本量和样本种类，使之有望成为预测PCOS患者脂代谢状态及IVF-ET助孕结局的新指标。