TK-1和TIMP-1过表达对大鼠心肌梗死后心室重塑的影响

郑 熙，余惠珍，高 洁，朱鹏立

（1.福建省立医院心血管内三科，福建福州 350001；2.福建省立医院南院内科，福建福州 350028；3.福建医科大学省立临床医学院老年医学研究室，福建福州 350001；4.福建省临床老年病研究所，福建福州 350001）

心肌梗死是严重危害人类健康的常见心血管疾病之一，其导致的死亡占心血管病死亡原因的50%以上。心肌梗死给机体带来的危害很大一部分是由于心肌梗死后心室重塑所造成的。心室重塑的发生发展主要包括心肌细胞、非心肌细胞及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的改变，组织基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）通过分解基质中的肽键来降解ECM，使心肌的顺应性下降。人组织基质金属蛋白酶抑制物1（human tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，hTIMP-1）是一种内源性的MMP 的天然抑制剂［1］。TIMP-1 作为MMP-2、MMP-9 的特异性抑制剂，不仅能阻止MMP-2、MMP-9 酶原的活化，同时还可抑制已活化的MMP-2、MMP-9［2］。既往实验提示TIMP-1基因敲除的小鼠，将导致其左心室发生肥大性改变、心功能恶化［3］。组织激肽释放酶（tissue kallikrein，TK-1）是丝氨酸蛋白酶［4］，具有心肌保护作用及治疗作用，通过缓激肽B2 受体能减少心肌缺血-再灌注的损伤［5-6］。心梗时缺血及坏死的心肌细胞会释放一系列促炎细胞因子和趋化因子，将炎症细胞募集到缺血区［7］。如巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等。MIF 在其中起到关键作用，它能诱导多种炎症因子生成［8］，其诱导的炎症因子可抑制心肌收缩，导致心室重塑和心肌细胞凋亡等［9］。目前有研究发现由促炎因子MIF 导致的心肌细胞凋亡，可被其抑制剂所抑制，从而改善心功能预后［10］。余细勇等［11］发现糖耐量异常可导致心肌细胞前炎症因子MIF 表达，通过调节G 蛋白藕联受体激酶影响心肌细胞能量代谢，从而影响心力衰竭的发生发展进程，我们推测对心梗后炎症反应的抑制能改善心室重塑。结合以上研究结果，TIMP-1 通过抑制细胞外基质从而改善心梗后心室重塑发生发展，而TK-1 通过多条机制路径发挥抗炎、保护血管内皮等作用，减轻心梗后心肌组织局部炎症反应，从而抑制心室重塑。本题组前期实验结果提示联合TK-1 与TIMP-1 可抑制血管平滑肌细胞的增殖及球囊拉伤后血管再狭窄效应，具有良好的生物学功能［1，12］。与传统的单基因转染相比，联合多基因转染不仅拥有更高的表达效率，还能使目的基因间发挥协同作用。如Gaballa等［13］研究发现采用Ang-1和VEGF联合基因转染心肌梗死猪的心肌组织，与单基因转染相比，其生成血管数量及成熟度都更好。故本实验采用hTIMP-1与TK-1联合基因转染改善大鼠心梗后心室重塑。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Sprague-Dawley 大鼠75 只，体质量250～300 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号SCXX（闽）2012-0001］。SD 大鼠饲养在福建医科大学实验动物中心，人工光源明暗各12 h，24 h 自由饮水取食，恒湿（55±5）%、恒温（22±2）℃。水、鼠饲料和鼠垫料由福建医科大学实验动物中心提供。动物实验的设计和实施均遵守福建医科大学的相关规定，通过福建医科大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 试剂和设备

本课题组前期构建并纯化保存的重组腺病毒包括：Ad-EGFP是一种仅含有EGFP基因作为对照病毒的腺病毒载体，Ad-hTK1-IRES-EGFP（TK-1），Ad-hTIMP1-IRES-EGFP（TIMP-1），Ad-hTK1-hTIMP1-IRES-EGFP（TK-1 和TIMP-1）［14-15］。

抗TK-1 抗体（ab59271，美国abcam 公司），抗TIMP-1 抗体（250883，美国ABBIOTEC 公司），抗MMP-2 抗体（sc-13595，美国Santa Cruz 公司），抗MMP-9 抗 体（10375-2-AP，美 国Proteintech 公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠二抗（福州迈新生物技术开发有限公司），蛋白提取试剂盒（上海碧云天公司），TUNEL 试剂盒（上海罗氏制药有限公司），4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。

1.3 动物分组

将75 只清洁级雄性Sprague-Dawley 大鼠按照体质量编号后，采用随机数字表法随机分成6 组。假手术组10 只穿线不结扎，死亡1 只，存活9 只；生理盐水组13 只在心梗交界区注射生理盐水，死亡5 只，存活8 只；对照病毒组13 只注射对照病毒，死亡4 只，存活9 只；TK-1 组13 只注射TK-1基因，死亡2 只，存活11 只；TIMP-1 组13 只注射TIMP-1基因，死亡4 只，存活9 只；联合基因组13 只注射联合基因，死亡3 只，存活10 只。其死亡原因可能为：术中大出血、术后室颤、术后肺部感染、严重心衰、大鼠互相撕咬所致。建模存活率约74.67%。

1.4 心肌梗死模型的构建及干预

100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。大鼠固定于操作板上连接心电图。取颈部正中切口约2～3 cm，行气管插管，连接小动物呼吸机（呼吸机频率为60 次/min，吸气呼气比为1∶1.5，潮气量约为3 mL/100 g，吸入氧浓度为100%）。左前胸取切口长约3～4 cm，暴露心脏，5-0 缝合线结扎左前降支。随后可见梗死区域心肌颜色变浅，在梗死交界区分别注射100 μL 生理盐水、对照病毒、TK-1、TIMP-1、联合基因［15］（病毒量均为1×1010pfu/只，保存于100 μL 的病毒稀释液）。缝合关胸。术后予10 万单位青霉素钠溶液腹腔注射，连续3 d。假手术组只用5-0 缝合线穿过左前降支而不结扎，其余步骤均同冠脉结扎组。

1.5 心功能检测

术后28 d，采用100 mL/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。用数字高帧频超声心动图评价各组大鼠心功能。检测左室舒张期内径（LVIDd）、左室收缩期内径（LVIDs）；根据公式计算射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）。每个参数连续记录3 个心动周期。

1.6 组织形态学分析

术后28 d，待超声心动图评估大鼠心功能后予处死大鼠。取大鼠心肌组织石蜡包埋切片（约3 μm）。HE 染色镜下观察心肌组织炎症细胞浸润；TTC 染色观察心肌梗死面积，Image-Pro Plus 6.0 图像软件分析各组大鼠心肌梗死面积。

1.7 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡

石蜡切片通透，滴加TUNEL 反应混合液，避光孵育。滴加converter-POD 避光孵育。加DAB显色液，苏木素复染。封片。凋亡细胞阳性指数（apoptosis index，AI）等于阳性凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.8 Western blot 检测

20 μg 总蛋白质上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（4%浓缩胶，12%分离胶）。于5%BSA 中室温封闭。一抗TK-1（0.5 μg/mL），TIMP-1（1 μg/mL），MIF（1 μg/mL），NF-κB（1 μg/mL），MMP-2（1.25 μg/mL），MMP-9（1.25 μg/mL），孵育过夜。二抗（0.2 μg/mL）孵育。Image-Pro Plus 6.0 图像软件分析目的蛋白与β-actin 灰度值比。

1.9 免疫组织化学法检测

石蜡切片抗原修复、封闭。一抗（MIF 4 μg/mL、NF-κB 4 μg/mL、MMP-2 5 μg/mL、MMP-9 5 μg/mL）孵育。二抗孵育，DAB 显色，脱水，透明，封片。光镜下每张切片随机选择3 个视野（400×），采用Image-Pro Plus 6.0 图像软件进行分析。

1.10 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计学软件进行分析。心功能参数、心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡指数、炎症因子及目的蛋白的表达量以均数±标准差表示。各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。方差不齐者，使用H检验（多组比较的秩和检验），表达量以中位数和四分位数表示。采用双侧检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因治疗组表达TK-1 和TIMP-1

Western blot 结果提示仅TK-1 组和联合基因组有TK-1 蛋白表达，且两组间TK-1 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；仅TIMP-1 组和联合基因组有TIMP-1 蛋白表达，且两组间hTIMP-1蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05；图1）。假手术组、生理盐水组、对照病毒组均无TK-1 或TIMP-1 蛋白表达。

图1 蛋白免疫印迹法观察大鼠心肌组织TK1 及TIMP1 的表达情况Fig.1 Expression of TK1 and TIMP1 in rat myocardium by Western blotting

2.2 腺病毒载体过表达TK-1 和TIMP-1 对大鼠心功能的影响

与假手术组相比，对照病毒组大鼠LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低（P＜0.01）。与对照病毒组相比，TK-1 组、TIMP-1 组或联合基因组LVIDd 降低，FS、EF 升高（P＜0.01）。与TK-1 组或TIMP-1组相比，联合基因组LVIDd 降低，以及FS、EF 升高更显著（P＜0.05）。生理盐水组与对照病毒组相比各项差异均无统计学意义（P＞0.05；表1）。

2.3 腺病毒载体过表达TK-1 和TIMP-1 对大鼠心肌组织梗死面积的影响

HE 染色镜下可见假手术组心肌细胞完整，无坏死或炎性细胞浸润，心肌横纹清晰可见；与假手术组相比，对照病毒组心肌组织中嗜酸性粒细胞浸润、中性粒细胞浸润、心肌细胞分布不均匀、甚至断裂；与对照病毒组相比，TK-1 组、TIMP-1组或联合基因组心肌损伤程度和炎症程度改善（图2）。与假手术组相比，对照病毒组心肌梗死面积百分比升高（P＜0.01）。与对照病毒组组相比，TK-1 组、TIMP-1 组或联合基因组心肌梗死面积百分比下降（P＜0.01）；相比于TK-1 组或TIMP-1组，联合基因组心肌梗死面积百分比降低更显著（P＜0.05）。生理盐水组与对照病毒组相比差异无统计学意义（P＞0.05；图3）。

表1 病毒载体转染后的各组大鼠心功能参数改变Table 1 Changes of cardiac function parameters in rats transfected with viral vectors［P50（P25～P75），（±s）］

表1 病毒载体转染后的各组大鼠心功能参数改变Table 1 Changes of cardiac function parameters in rats transfected with viral vectors［P50（P25～P75），（±s）］

LVIDs：Left ventricular systolic diameter；LVIDd：Left ventricular diastolic diameter；FS：Shortening rate of short axis；EF：Ejection fraction.For LVIDs：H values between groups is 4.271.1）Compared with sham operation group，P=0.007，0.021；2）Compared with control virus，P=0.036，0.041，0.029；3）Compared with TK-1 group，P=0.064；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.085.For LVIDd：F values between groups is 1.433.1）Compared with sham operation group，P=0.022，0.039，0.31，0.27，0.53.For FS：F values between groups is 22.443.1）Compared with sham operation group，P=0.000，0.000；2）Compared with control virus，P=0.001，0.001，0.00；3）Compared with TK-1 group，P=0.037；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.047.And for EF：F values between groups is 26.802.1）Compared with sham operation group，P=0.000，0.000；2）Compared with control virus，P=0.006，0.002，0.00；3）Compared with TK-1 group，P=0.003；4）Compared with TIMP-1 group，P=0.01.The sample size of each group：n=4.One-way chi-square analysis.

图2 各组大鼠左室形态学变化（200×）Fig.2 Morphological changes of left ventricle in rats of each group（200×）

2.4 腺病毒载体过表达TK-1 和TIMP-1 对大鼠心肌细胞凋亡的影响

与假手术组相比，对照病毒组大鼠AI 升高（P＜0.01）。与对照病毒组相比，TK-1 组、TIMP-1或联合基因组AI 下降（P＜0.01）。与TK-1 组或TIMP-1 组比较，联合基因组AI 降低更显著（P＜0.05）。生理盐水组与对照病毒组相比，AI 差异无统计学意义（P＞0.05；图4）。

图3 病毒载体转染后对各组大鼠左室梗死面积的影响Fig.3 Influences of viral vector transfection on left ventricular infarct size in rats of each group

2.5 腺病毒载体过表达TK-1 和TIMP-1 对大鼠心肌组织炎症因子水平的影响

与假手术组相比，对照病毒组大鼠心肌组织各炎症因子的表达水平升高（P＜0.05）。与对照病毒组相比，TK-1 组、TIMP-1 组或联合基因组各炎症因子表达水平下降（P＜0.05）。与TK-1 组或TIMP-1 组比较，联合基因组各炎症因子的表达水平降低更显著（P＜0.05）。生理盐水组与对照病毒组相比，各炎症因子表达差异无统计学意义（P＞0.05；图5～9）。

图4 病毒载体转染后对对各组大鼠心肌细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of viral vector transfection on myocardial cell apoptosis in rats

3 讨论

心梗后的病理过程受到许多因素的影响，其中炎症反应对于纤维化愈合至关重要［16］。急性心梗后在梗死区域大量的炎症因子生成，NF-κB 在炎症反应中启到了枢纽的作用［17］，它与众多的炎性因子相互激活、活化，形成连锁式爆发反应［9］，通过减少心梗区域内NF-κB 的表达，能抑制心肌细胞凋亡，改善心功能及心室重塑等［18］。此外，MIF 也是炎症反应中不可忽视的一部分，它被称为多效性炎性细胞因子［19］，它不仅能激活IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子、加剧炎症反应［8］，而且还能抑制心肌收缩、恶化心功能，导致心肌细胞凋亡以及心室重塑等［9］。随着基因工程技术的发展，已有相关报道称MIF 基因多态性与心血管疾病相关［20-21］，近期针对中国人口的研究报道称，携带有-173C MIF 等位基因的女性患冠心病的风险更高［22］。MIF 可通过CD74/CD44 受体介导，经由Akt 通路激活NF-κB，而活化的NF-κB 可与MIF 形成正性环路。机体外周循环中MIF 水平与心肌梗死面积和梗死后心脏重塑程度有关［23］。另有动物实验表明采用MIF 抑制剂拮抗MIF 作用，在许多炎症疾病和心血管疾病中有可能阻断疾病进展［24-25］。

图5 病毒载体转染后对各组大鼠心肌组织MMP-2 表达的影响（400×）Fig.5 Effect of viral vector transfection on the expression of MMP-2 in myocardium of rats in each groups（400×）

图6 病毒载体转染后对各组大鼠心肌组织MMP-9 表达的影响（400×）Fig.6 Effect of viral vector transfection on the expression of MMP-9 in myocardium of rats in each groups（400×）

此外，ECM 的改变对心室重塑启着至关重要的作用，活化的MMP-2 与MMP-9 能够降解心肌细胞外的基质，引起急性左室破裂和慢性心室扩大［26］，而它们的转录启动受到MIF、NF-κB 以及TNF-α等的调节［27］，MIF 激活MMP-2 与MMP-9 可能是通过MEK1/2-JNK（AP-1）-MMP这条通路［17］。相反，MIF 的敲除可降低心肌梗死后MMP-9 和MMP-2 的表达和活性［28］。

图9 病毒载体转染后对各组大鼠心肌组织各目的蛋白表达的影响Fig.9 Effect of viral vector transfection on expression of various target proteins in myocardial tissue of rats

本实验采用联合基因对心梗大鼠进行干预基于以下两点。一方面，TK-1 作用于B2 受体后，可激活PI3K-Akt-eNOS 途径，进而促进一氧化氮的生成［29-30］，减轻心肌细胞的氧化损伤、抑制炎症因子的活化，从而改善心功能等［31-33］；心梗后的炎症反应与活化的NF-κB 以及血管细胞黏附分子1 等炎症因子有密切联系，TK-1 可通过上述机制抑制NF-κB等炎症因子［18］，从而抑制MIF与NF-κB炎症瀑布反应起始，进而减少下游MMP-2、MMP-9等因子的表达，达到延缓心室重塑改善心功能等效应；另一方面，TIMP-1 是内源性的MMP-2 与MMP-9的天然抑制剂，它不仅能阻止MMP-2与MMP-9酶原的活化，还能抑制已活化的MMP-2和MMP-9［2］，使它们失去降解ECM 的能力。同时TIMP-1 作用于CD63 后激活PI3K-Akt 路径，抑制心梗后的心肌细胞凋亡［34］。以上研究支持我们的推测：双基因共表达可能通过共同抑制MIF/NF-κB/MMP-2/9炎症通路、改善ECM代谢等共同作用，使两种目的蛋白抑制炎症反应产生协同效应，从而发挥更强的抗炎效果、改善心室重塑。然而对于TK-1和TIMP-1发挥生物学效应的详细机制，特别是细胞内信号传导通路方面以及转录因子调控方面的具体机制仍不明了，有待进一步深入的研究。