利用SSR标记筛选水稻富γ-氨基丁酸后代材料

王康恺 赵娜 马嘉欣 王迎超 田玲 杨治伟 洪缘缘 田蕾 张银霞 杨淑琴 李培富

摘要：以高粱稻-1和宁农黑粳的杂交F2代和F4代为试验材料，在实验室前期已获得的稻米籽粒中控制γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量的3个数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）位点基础上，进一步利用简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）标记对其进行基因型检测，获得了不同基因组合类型，在此基础上利用高效液相色谱法，测定各基因组合类型籽粒中GABA含量，探讨GABA含量与其类型间的关系。结果表明，在F2代和F4代的所有组合类型中，代表高含量纯合基因组合类型（BBA组合）中GABA含量的检测结果均值最高，代表低含量纯合基因组合类型（AAB组合）中GABA含量的检测结果均值最低，其检测结果与基因型表现一致。显著性分析表明，GABA含量与不同基因组合类型之间存在极显著相关性。同时还表明，相比F2代，F4代的BBA组合中GABA的平均含量增高，AAB组合中GABA的平均含量降低，且变异程度均有降低，特别是低含量纯合基因组合类型材料的符合度从53%上升到75%，其结果表明，低含量纯合基因组合类型材料有趋于稳定的趋势。试验结果可应用于利用分子标记辅助选择富γ-氨基丁酸杂交后代材料的研究中。

关键词：水稻;γ-氨基丁酸;高效液相色谱;糙米;籽粒;基因型组合;SSR标记

中图分类号： S511.032文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）08-0078-07

收稿日期：2019-03-18

基金项目：国家自然科学基金（项目编号：31360324、31760374、31401361）;宁夏农业育种专项课题（编号：2018NYYZ0302）。

作者简介：王康恺（1991—），男，陕西华阴人，硕士研究生，主要研究方向为水稻遗传育种。E-mail：1033678950@qq.com。

通信作者：李培富，博士，教授，主要从事水稻遗传育种研究。E-mail：peifμLi@163.com。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又称γ-氨酪酸，是一种天然存在的非蛋白组成性氨基酸[1]。γ-氨基丁酸不仅在植物组织中存在，同时也在哺乳动物和人类的中枢神经系统中存在，是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，参与人体内多项代谢及生理活动，具有降血压、健脑、活化肝肾及调节免疫等功能，被誉为“大脑的天然镇静剂”[2]。为了实现“药食同源”，调节人体生理功能，尤其是对GABA摄入量有特殊要求的人群而言，研究并开发富含GABA的水稻新品种显得非常必要。

目前，国内外对于γ-氨基丁酸的研究主要集中在其生理功能[3-5]、测定方法[6-7]以及发芽糙米工艺优化[8]等方面，对富含GABA新品种培育的研究相对较少。目前，张标金通过测定巨胚稻和常规稻糙米中的GABA含量发现，巨胚稻糙米中GABA的平均含量显著高于常规稻，并从中筛选出富含GABA的巨胚稻GE091[6];Maeda等以金南风（Kinmaze）的巨胚突变体作为杂交亲本，培育出了巨胚水稻新品种Haiminori，Haiminori籽粒中的GABA含量比日本晴、越光等普通水稻品种籽粒中的γ-氨基丁酸含量高3～4倍[9];日本利用九州大学的变异巨胚系统EM40和中国农试高产品种明光诺里杂交，选育出富γ-氨基丁酸水稻新品种海米诺里[10]，其胚芽内的GABA含量比普通品种高约4倍。

本试验通过检测杂交F2代182份材料和杂交F4代109份材料的基因型，将所有材料按基因型组合进行分类，利用高效液相色谱法，测定各基因型组合籽粒中γ-氨基丁酸含量，分析不同类型材料γ-氨基丁酸含量与基因型的相关性，旨在为利用分子标记辅助选择培育富γ-氨基丁酸新品种提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试水稻材料

试验材料由宁夏大学农学院作物遗传育种实验室提供，包括高粱稻-1和宁农黑粳杂交F2，共182份单株材料。试验材料于2017年10月在海南省三亚育种基地种植，采用播后上水的方式，常规田间管理方法，成熟时单株收获。再于2018年5月在宁夏大学水稻育种基地种植，采用旱育秧方式育苗，单株移栽，田间采用常规栽培管理方法，成熟后收获单株材料109份。

1.1.2 试验用相关引物

本试验所用引物来自笔者所在实验室前期构建的简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）引物连锁遗传图谱，以GABA含量为10.47 mg/100 g的高粱稻-1作为父本，以GABA含量为5.57 mg/100 g的宁农黑粳作为母本，以杂交F2群体为基础，筛选出贡献率最高的3个数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）位点，再对其进行优化。结果如表1所示，其中qGABA-8-1和qGABA-8-2来自母本宁农黑粳，qGABA-9来自父本高粱稻-1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 籽粒γ-氨基丁酸含量的测定

本试验采用水提法（参照程威威等的提取方法[7，11]并进行优化），提取水稻糙米中的GABA。將收获的182份杂交F2代和109份杂交F4代籽粒于60 ℃烘箱中烘干备用，使用砻谷机脱壳，磨粉机研磨，过80目筛，准确称取糙米粉（1.000 0±0000 2） g，每份材料重复3次，倒入50 mL离心管中，加入15 mL超纯水，混匀，60 ℃、120 r/min水浴振荡浸提90 min，12 000 r/min 离心20 min，将上清液移入圆底烧瓶中，重复上述操作，将2次上清液混合，用旋转蒸发仪在96 ℃下旋转蒸发，最后浓缩到5 mL，过 0.2 μm 有机滤膜，得到糙米中γ-氨基丁酸提取液，然后将提取液进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）柱前衍生，使用安捷伦1220高效液相色谱仪进行测定，并绘制标准曲线，计算籽粒γ-氨基丁酸含量。

根据表2中的数据，以γ-氨基丁酸标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制出γ-氨基丁酸浓度与峰面积的标准曲线（图1），拟合标准曲线方程为：y=1 133 314x-1 023.11，相关系数r2=0997 4。

1.2.2 叶片DNA的提取及检测

本试验采用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取叶片中的DNA，以DNA为模板进行PCR扩增，配制20 μL反应体系，其中10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，2.5 μmol/mL dNTP 0.4 μL，引物（2 mmol/L）15 μL，Taq酶0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用ddH2O补足20 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個重复;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳检测，银染显色，包胶，并于胶片观察灯下观察，读胶。

1.3 试验数据处理

电泳后，读取杂交后代群体的条带，将与宁农黑粳带型一致的条带记为B，与高粱稻-1带型一致的条带记为A，双亲杂合型条带记为H，缺失记为“-”。在Microsoft Excel表中整理统计4种带型数据，用Microsoft Excel完成试验数据的处理及绘图，并用SPSS19.0分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 杂交后代群体基因型分析

将所用引物合成，按要求稀释，然后进行PCR扩增反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，部分结果如图2所示，统计全部结果得出，其中有效条带占全部条带的 94.65%，数据可靠性较高，可用于下一步检测分析。

2.2 杂交后代单株籽粒基因型组合及其对应γ-氨基丁酸含量

对杂交F2代和F4代材料的单株籽粒基因型进行分类，并对其相应GABA含量进行统计，结果如表3、表4所示。由表3可以看出，F2群体中，GABA含量最高为 15.02 mg/100 g，其基因组合类型为BBH，最低为377 mg/100 g，其基因组合类型为AAB，其中纯合基因型组合材料中GABA含量最高为12.15 mg/100 g，对应基因组合类型为BBA;由表4可以看出，F4群体中，GABA含量最高为 12.89 mg/100 g，其基因组合类型为BBB，最低为299 mg/100 g，其基因组合类型为AAB。综上，在F2、F4代群体中，GABA含量最低的材料基因型组合均为AAB，但最高含量来自不同基因型组合。

2.3 杂交后代籽粒中γ-氨基丁酸含量与其基因组合类型的差异显著性分析

由图3可以看出，HHA、BBA基因组合类型的GABA含量高于BBB、HBH、HHH、HAH、HHB、AAA、AAH、HAB、AAB基因组合类型，AAH、HAB、AAB类型含量低于BBH、HHA、BBA类型，且均呈极显著差异。其中HHA、BBA基因组合类型材料的GABA平均含量较高，分别为10.08、9.87 mg/100 g，AAB基因组合类型材料平均含量最低，为 5.98 mg/100 g，前者分别是后者的1.69、1.65倍。从遗传学角度来看，杂合材料存在分离且稳定性不高，所以选择纯合BBA类型进行后代遗传。由图4可以看出，BBA类型GABA含量高于HHB、BBH、AHB、HHH、HBB、HAB、AAB类型，AAB类型含量低于BBA、BBB、BAB、BHH类型，也均呈极显著差异。其中BBA类型材料的GABA平均含量最高，达 10.12 mg/100 g;AAB类型材料平均含量最低，为3.30 mg/100 g;BBA类型材料是AAB的3.07倍。综上，F2、F4代群体中，GABA平均含量最低的均为AAB类型材料，且含量有下降趋势，BBA类型材料从F2到F4代变为最高，且平均含量有所提高。

2.4 不同基因组合类型间GABA含量的比较

由表5可以看出，F2代中，纯合AAB基因组合类型材料γ-氨基丁酸含量的平均值为（5.98±1.15） mg/100 g，变异范围为3.77～7.98 mg/100 g，变异系数为1930%;纯合BBA基因组合类型材料γ-氨基丁酸含量的平均值为（9.87±1.24） mg/100 g，变异范围为 8.18～12.15 mg/100 g，变异系数为1256%。由表6可以看出，F4代中，纯合AAB基因组合类型材料γ-氨基丁酸含量的平均值为（3.30±0.47） mg/100 g，变异范围为2.99～4.10 mg/100 g，变异系数为14.11%;纯合BBA基因型材料γ-氨基丁酸含量的平均值为（10.12±121） mg/100 g，变异范围为8.10～12.08 mg/100 g，变异系数为11.96%。综上， 从F2代到F4代，纯合AAB、BBA基因组合类型材料变异系数均有降低，其中AAB降低幅度较大，且均值都有向其最低或最高方向变化的趋势。由表5、表6还可以看出，杂合基因型材料变异系数不稳定。

2.5 纯合高含量与低含量基因组合类型材料符合度的比较

为进一步探究纯合高含量基因组合类型BBA和纯合低含量基因组合类型AAB材料的稳定性，对这2种组合类型的符合度进行了统计。结果（表7）表明，F2、F4代中BBA类型材料的符合度均为50%，AAB类型材料的符合度分别为53%、75%，相比纯合高含量基因组合类型材料，纯合低含量基因组合类型材料的符合度随着世代增加有所增加，说明纯合低含量基因组合类型材料稳定性更高。

3 结论与讨论

3.1 水稻籽粒中γ-氨基丁酸含量测定方法比较

γ-氨基丁酸作为一种新型的功能性因子，其测定方法目前在我国还没有明确统一标准[12-13]。比色法和高效液相色谱法（HPLC）是这些年比较常用的2种测定γ-氨基丁酸含量的方法，但是均有优缺点。比色法利用游离氨基酸与苯酚和次氯酸钠反应，生成有色物质，进行比色测定。这一方法操作简便，设备简单，适合大规模测定。但是水稻糙米中的GABA含量普遍较低，所以在对其进行检测时，其他物质产生的颜色会对分光光度计显色反应造成影响，使其准确度降低。HPLC检测的原理是γ-氨基丁酸与一些特殊的化学试剂发生柱前衍生反应后，生成一种能被紫外-可见光检测到的稳定荧光物。这一方法分离度较高、重复性较好、精密度较高、结果比较准确，但试剂昂贵，程序也较为繁琐。程威威等对比分析了邻苯二甲醛（OPA）、丹磺（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）等作为柱前衍生试剂，检测发芽糙米中的γ-氨基丁酸含量结果，发现OPA虽然衍生时间比较短，但其衍生产物较不稳定，易分解[7，14];Dansyl-Cl衍生过程比较复杂，不仅需要避光保存，而且其衍生产物也相对较不稳定[15];而AQC作为一种较为新型的柱前衍生试剂，衍生反应时不仅反应迅速，灵敏度较高，而且衍生产物也较为稳定[16]。唐涛等在研究中均证实了AQC的优越性[17-19]。因此，本试验采用高效液相色谱法，并用AQC作柱前衍生，检测籽粒中γ-氨基丁酸含量。

3.2 水稻籽粒γ-氨基丁酸含量与基因型的相关关系

王迎超研究发现，高粱稻-1与宁农黑粳杂交组合F1代籽粒γ-氨基丁酸含量介于双亲之间，F2代籽粒γ-氨基丁酸含量呈偏正态分布，并出现超亲现象[2]。本试验在此基础上，依据3个QTL位点，对杂交F2代和F4代进行基因型组合分类，具体分析结果表明，不同基因组合类型与γ-氨基丁酸含量之间呈极显著相关，代表高含量纯合基因型（BBA组合）中GABA的检测结果均值最高，代表低含量纯合基因型（AAB组合）中GABA的检测结果均值最低，其检测结果与基因型表现一致。显著性分析结果表明，GABA含量与其基因组合类型之间存在极显著相关性。F2代BBA类型材料的GABA平均含量 （9.87 mg/100 g） 是AAB类型材料平均含量（5.97 mg/100 g）的1.65倍，F4代BBA类型材料平均含量（10.12 mg/100 g）是AAB类型材料GABA平均含量（3.30 mg/100 g）的3.07倍。结果表明，相比于F2代，F4代的BBA组合中GABA的平均含量增高，且F4代的AAB组合中GABA的平均含量降低，变异程度也均有所降低，特别是低含量纯合基因型材料符合度从53%上升到75%，其结果表明，低含量材料γ-氨基丁酸含量趋于稳定程度较高。

3.3 富γ-氨基丁酸水稻品种的选育

本试验在王迎超的研究基础[2]上进行延伸，利用分子标记辅助技术筛选富γ-氨基丁酸的水稻新材料，不仅可以缩短育种年限，也能快速选择出富γ-氨基丁酸的水稻新品种。有关水稻籽粒中控制γ-氨基丁酸含量的遗传学研究起步较晚，目前，籽粒中控制γ-氨基丁酸含量的QTL位点并没有得到精细定位。本试验结果证明，控制GABA基因定位的准确性，可为分子标记辅助选择富含γ-氨基丁酸的水稻新品种以及控制γ-氨基丁酸含量的候选基因筛选奠定基础。

参考文献：

[1]王迎超，王全兴，王 浩，等. 富γ-氨基丁酸水稻种质筛选及与籽粒性状的相关性分析[J]. 植物遗传资源学报，2016，17（6）：1116-1122.

[2]王迎超. 水稻γ-氨基丁酸含量的遗传分析及QTL定位[D]. 银川：宁夏大学，2016.

[3]张祥喜，袁林峰，刘 凯，等. 富含γ-氨基丁酸（GABA）的巨胚功能稻研究进展[J]. 江西农业学报，2007，19（1）：36-39.

[4]张琳琳，舒小丽，卢怀江，等. 富含γ-氨基丁酸降压功能稻米研究进展[J]. 核农学报，2006，20（3）：218-220.

[5]王 辉，项丽丽. γ-氨基丁酸（GABA）的功能性及在食品中的应用[J]. 食品工業，2013，6（34）：186-189.

[6]张标金. 用基于邻苯二甲醛柱前衍生的高效液相色谱法测定稻米的γ-氨基丁酸含量[J]. 江西农业学报，2013，25（11）：105-107.

[7]程威威. HPLC法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸中不同衍生方式的比较研究[J]. 中国农学通报，2014，30（9）：279-284.

[8]李常钰，王超超，杨慧萍. 发芽糙米中γ-氨基丁酸的富集与测定[J]. 粮食与饲料工业，2011（2）：4-7.

[9]Maeda H，Nemoto H，Iida S，et al. A new rice variety with giant embryos，“Haminori”[J]. Breeding Sci，2001，51：211-213.

[10]姜 宾. 日本育出巨大胚水稻新品种[J]. 天津农林科技，2001（4）：45.

[11]房克敏，李再贵，袁汉成，等. HPLC法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量[J]. 食品科学，2006，27（4）：208-211.

[12]田小磊，吴效岚. γ-氨基丁酸在高等植物逆境反应中的作用[J]. 生命科学，2002，14（4）：215-219.

[13]徐瑞萍. γ-氨基丁酸在发芽糙米中检测方法与综述[J]. 山东化工，2012，41（11）：35-37.

[14]陈 稚. 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究[D]. 长沙：湖南师范大学，2006.

[15]Huang X，Chen J W，He L P，et al. Detection of monoamine neurotransmitters and its metabolites by high performance liquid chromatograph after pre-colum derivatization of dansyl chloride column[J]. Europe Pub Med Central，2012，46（12）：51-53.

[16]覃婷婷，白海娇，黄哲苏，等. AQC柱前衍生法在氨基酸分析测定中的应用[J]. 天津药学，2010，22（5）：51-53.

[17]唐 涛. 氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用[D]. 南京：南京理工大学，2006.

[18]吕莹果，张 晖，孟 祥. 氨基酸分析测定及衍生化方法[J]. 粮食与油脂，2009（7）：35-38.

[19]王秀中，王清清，宋海峰. 衍生化技术在氨基酸分析中的应用进展[J]. 药物分析杂志，2010，30（6）：1162-1166.