气相色谱-串联质谱动态多反应监测模式测定陈皮中88种农药残留

闫 君，陈 婷，张 文，张 婕，苗 茜

(兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050)

陈皮为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]，药用历史悠久，始载于《神农本草经》，其气香，味辛、苦，性温，主要含挥发油、黄酮类、生物碱、肌醇等成分[2]，具有理气健脾，燥湿化痰之功效。陈皮是国际国内市场需求量大的常用药材，若其原料柑橘在种植过程中盲目施用大量农药会导致农残超标[3]，且多集中于果实表皮，严重影响陈皮的质量安全及开发应用。因此，建立陈皮中农药残留快速检测方法对促进其产业发展的现代化、国际化进程具有重要意义。

目前，农残检测技术主要有气相色谱法[4]、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法[5-6]和液相色谱-质谱法[7]等，其中气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法因具有灵敏度高、选择性好，已成为主要分析方法。陈皮中农残的前处理方法主要为固相萃取法[8]，但其试剂消耗大，操作步骤繁琐，费时费力；QuEChERS方法通过液-液微萃取，可快速、简便、低成本的去除干扰物质[9]，广泛用于水果、蔬菜等中的农残检测[10-11]，其前处理辅助材料陶瓷均质子因可节约萃取时间、防止盐类结块、提高萃取效率等优点已被应用于《GB 23200.133-2018》[12]，鲜有报道将其用于中药材中农残检测。基于此，本文结合日常柑橘类水果检测结果、文献报道[13]及药典规定的农药种类，建立了陈皮中88种农药的QuEChERS/气相色谱-质谱分析方法，方法操作简单、耗时短、灵敏度高、选择性和重现性好，可满足陈皮中农药残留的分析要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7000D气相色谱-串联质谱联用仪(美国Agilent公司)；移液枪、Centrifuge 5810R高速离心机(德国Eppendorf公司)；ME204/02万分之一电子天平、MS205DU十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)；EVA50A氮吹仪(中国北京普立泰科仪器有限公司)；KS501摇床(德国IKA公司)；VORTEX-5涡旋混匀器(中国其林贝尔仪器制造有限公司)；0.22 μm有机滤膜(中国天津博纳艾杰尔科技有限公司)；西贝乐料理机(中国上海帅佳电子科技有限公司)，SiO-6512 QuEChERS全自动样品制备系统(配涡流振动离心机，12位均质离心转子，均质分离工作站，北京Ability公司)，2 cm(长)×1 cm(外径)两侧为斜切面的陶瓷均质子(美国Agilent公司)。

88种农药标准品(纯度≥95%，德国Dr Ehrenstorfer公司)；乙腈、正己烷(色谱纯，德国Merck公司)；丙酮(色谱纯，天津科密欧公司)；无水硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、石墨化炭黑(GCB)(中国天津博纳艾杰尔科技有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水(德国默克化工(技术)上海有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备溶液的配制精密称取10 mg(精确至0.01 mg)各农药标准品分别于10 mL容量瓶中，根据需要分别选择丙酮或正己烷稀释并定容至刻度，配成质量浓度为1 mg/mL左右的农药单标储备液，于-18 ℃避光保存，待用。

1.2.2 混合标准工作溶液的配制分别准确移取一定体积的农药单标储备液于25 mL容量瓶中，加入正己烷稀释并定容至刻度，配成质量浓度为8 mg/L左右的混合农药标准溶液，于-18 ℃避光保存，用于质谱离子对确认和出峰时间的确定。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品制备陈皮购自兰州市药材市场，粉碎研成末后过3号筛，混匀，按四分法留样200 g，避光保存，备用。

1.3.2 陈皮样品前处理提取：取2 g(精确至0.01 g)陈皮样品于50 mL离心管中，加入一颗陶瓷均质子，再加入10.0 mL 1%冰醋酸溶液涡旋30 s后，静置30 min，待样品充分浸润后加入10.0 mL乙腈，振荡10 min，加入5.0 g QuEChERS 盐包(含4.0 g无水硫酸镁、1.0 g无水乙酸钠)，涡旋混合均匀1 min，在室温下静置5 min后以3 900 r/min离心5 min，取上清液，待净化。

净化：取5.0 mL上清液转入QuEChERS净化管(含200 mg PSA、100 mg C18和30 mg GCB)中，混匀，涡旋1 min，以3 900 r/min离心5 min，取2.00 mL上清液于7 mL离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入2.00 mL正己烷，涡旋溶解，过0.22 μm有机滤膜，待气相色谱-质谱测定。

1.4 分析条件

气相色谱条件：HP-5MS UI气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min升至310 ℃，保持3 min；载气为氦气，流速1.2 mL/min；进样量1.0 μL；不分流进样。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃；动态多反应扫描模式(dMRM)；溶剂延迟3.5 min；Agilent MassHunter工作软件，其他质谱参数见表1。

表1 88种农药的CAS号、保留时间、离子对及碰撞电压Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of 88 pesticides

(续表1)

2 结果与讨论

2.1 动态多反应监测(dMRM)方法的建立

取88种农药的混合标准溶液在m/z50～500范围内进行全扫描，使用NIST标准库匹配检索，确证目标物的保留时间和特征离子碎片，优化碰撞能量。结果显示，与多反应监测模式(MRM)相比，dMRM是对每个组分的保留时间窗口进行动态分配，检测多种化合物也无需分时间段，可简化分析流程、改善峰形、提高分析效率和灵敏度，适合一针分析多种化合物。88种农药的定量离子、定性离子及碰撞能量结果见表1，在动态多反应监测模式扫描下的总离子流图见图1。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取条件优化利用药典四部通则2341气相色谱-质谱方法进行提取后，发现有部分无水硫酸镁和无水乙酸钠遇水结块，为避免无水硫酸镁结块影响除水效果和消除因结块包裹目标物造成回收率下降，需在提取环节中加入陶瓷均质子。陶瓷均质子2 cm(长)×1 cm(外径)两侧为斜切面的圆柱体陶瓷，可在振荡过程中通过剪切力将样品和结块的无水硫酸镁进一步切碎混匀，增大陈皮与提取液比表面积，还可使陈皮中的内吸性农药进一步被释放提取，从而提高农药的回收率。在提取环节比较了加入一颗和加入两颗陶瓷均质子的回收率，发现加入两颗陶瓷均质子与一颗陶瓷均质子的回收率基本一致，表明加入一颗陶瓷均质子即可满足提取需要。为确保提取过程有充足振荡空间，在药典提取方法的基础上按比例缩减提取试剂，最终提取方法为：称取2 g样品，加入一颗陶瓷均质子和10.0 mL 1%冰醋酸溶液，再加入10.0 mL乙腈提取。

图1 陈皮中88种农药在动态多反应监测模式扫描下的总离子流图(0.1 mg/kg)Fig.1 Total ion chromatograms of 88 pesticides(0.1 mg/kg) using dMRM mode in Pericarpium citri reticulatae

2.2.2 净化条件优化QuEChERS净化管通过分散吸附剂吸附样品中的杂质进而达到净化的目的,常用于基质复杂样品[14]，常用的吸附剂有C18、石墨化炭黑(GCB)和PSA。其中C18可去除脂类等疏水性杂质；GCB用于去除色素类物质；PSA作为一种弱阴离子交换剂用于去除脂肪酸等物质[15]。本研究参考2015版药典四部通则2341方法第四法[16]并结合陈皮中的主要成分，在空白陈皮样品添加0.1 mg/kg混合农药标准溶液，并设计PSA(100、200、300 mg)、C18(100、200、300 mg)和GCB(15、30、45 mg)用量的3因素3水平正交试验，以待测物的平均回收率验证其净化效果。结果显示，3个因素的主次关系为GCB>C18>PSA，且根据88种农药的平均回收率及回收率在80%～120%的农药数量，确定最佳PSA、C18和GCB的用量分别为200、100、30 mg。

2.3 基质效应

基质效应(ME)是由基质引起的检测信号增强或减弱，在气相色谱分析中普遍存在，且多表现为基质增强效应，对定量准确性和重复性具有一定影响[17-18]。由于陈皮基质成分复杂，因此需对其基质效应进行评价，本研究采用提取后加入法和绝对基质效应法评价基质效应[19-20]：ME(%)=100%×(A-B)/B，式中A为农药在基质匹配标准溶液中的响应值，B为农药在纯溶剂中的响应值，当ME%低于-20%为基质抑制效应，在-20%～20%之间时为弱基质效应；大于20%为基质增强效应。结果显示：88种农药的ME(%)均为正值，且其中11种(邻苯基苯酚、二苯胺、氟乐灵、甲基毒死蜱、环氧七氯、六氯苯、甲霜灵、艾氏剂、腐霉利、氯丹、狄氏剂)农药表现为弱基质效应，其余77种农药为基质增强效应(ME(%)为21.5%～145%)。因此实验采用基质匹配标准曲线校正，以减弱基质效应对目标化合物定量结果的影响。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围取空白陈皮样品，按“1.3.2”方法处理后，添加88种农药混合标准溶液配成质量浓度为9.0～220 ng/mL的基质匹配标准工作液，在优化条件下测定，以各农药的定量离子峰峰面积响应值(y)对其质量浓度(x)绘制标准曲线。结果显示，88种农药在各自的浓度范围内线性良好，相关系数(r2)均不低于0.996 3。

2.4.2 检出限与定量下限取阴性陈皮空白样品，按“1.3.2“方法制得空白基质溶液，向其中添加一定量农药混合标准溶液，配成质量浓度为9.0～220 ng/mL的混合农药标准工作液，在优化条件下测定，分别以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果表明：88种农药的LOD为0.001 0～0.050 0 mg/kg，LOQ为0.002 0～0.100 0 mg/kg(表2)。

2.4.3 回收率与相对标准偏差准确称取2.0 g空白陈皮样品进行加标回收率实验，添加水平为0.045～0.55 mg/kg，每个浓度平行6个。结果显示，88种农药的平均回收率为60.1%～118%，相对标准偏差(RSD)为0.30%～13%(表2)。表明方法具有较高的准确度和良好的精密度。

表2 88种农药的线性范围、相关系数、回收率、相对标准偏差(n=6)、检出限及定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficient(r2),recoveries,RSDs(n=6),LODs and LOQs of 88 pesticides

(续表2)

图2 检出14种农药的陈皮样品的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of Pericarpium citri reticulatae samples with 14 pesticides detected the number 1-25 were the same as those in Table 3

2.5 实际样品检测

采用本方法在优化条件下对市售陈皮进行检测(表3)，结果显示，26批次陈皮中农药检出率为100%，88种农药中共检出25种，最少的样品检出2种农药，最多的检出14种(图2)，其中杀扑磷的检出率最高，咪鲜胺的残留量最高。虽然陈皮中农药检出率高，但其整体残留量较低，这可能与其制作过程需长时间晾晒有关。

表3 陈皮中农药的检出结果Table 3 Detected results of pesticide residues in Pericarpium citri reticulatae

(续表3)

3 结 论

优化了QuEChERS前处理方法，利用GC-MS/MS动态多反应监测(dMRM)模式检测技术，建立了陈皮中88种农药的检测方法。方法在提取环节加入陶瓷均质子可以最大限度地减少人员之间的误差，提高了结果的一致性及重现性，并提高了农药残留回收率，同时也为药典农残检验方法的完善提供了参考依据。通过样品实测证明本方法操作简单、检测分析时间短、灵敏度高，可用于陈皮中多种农药残留的快速筛查，具有实际应用价值。