同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱法测定人血清中孕酮

2020-06-01薛晋美李会强

分析测试学报 2020年5期

薛晋美，孙光，李会强，那平，乔斌*

(1.天津大学化工学院，天津 300350；2.天津市公安医院检验科，天津 300042；3.天津医科大学检验学院，天津 300203)

孕酮(Progesterone)又称黄体酮，是一种具有重要生物活性的类固醇激素，其在非孕期女性体内主要由卵巢黄体分泌，孕期女性主要由胎盘分泌，在内分泌、生殖、经期过程方面起关键调控作用。其在男性体内主要在促肾上腺皮质激素调控下由肾上腺分泌[1]。作为一种神经类固醇，孕酮在大脑神经方面也有重要的信号调节功能[2]。成年女性血清中的孕酮浓度通常在0.15～25 ng/mL之间，孕期约升高至230 ng/mL[3]；男性和更年期女性体内的孕酮浓度较低，在1～3 nmol/L之间[2]。血清中的孕酮大多以蛋白结合形式存在，游离孕酮占总孕酮浓度的比例在2%～10%之间变化，但在正常经期女性体内游离孕酮的比例保持恒定[3]。血清中孕酮的准确测定对于黄体功能、宫内妊娠、自然流产等的确认以及其它疾病的诊断具有重要的临床意义。

放射免疫测定(RIAs)和酶联免疫吸附测定(ELISAs)是最常用的激素测定方法[4]。免疫法的灵敏度高，但由于抗体的交叉反应、基质干扰等因素会存在准确性差[5-7]、动态范围窄[8]等缺陷。此外，孕酮等类固醇激素的检测方法还有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[9-12]。人血清中孕酮的临床检测早期采用同位素稀释气相色谱-质谱法(ID GC-MS)，但需进行复杂的衍生化且分析时间较长[13-14]。随着质谱技术的发展，同位素稀释液相色谱-串联质谱法(ID LC-MS/MS)因具有灵敏度高、特异性强、样品处理简单等优点，目前被认为是临床检测和研究的首选方法。LC-MS/MS法已被开发用于血清中孕酮的分析[15-17]。美国国家标准研究院(NIST)建立了血清中孕酮的ID LC-MS/MS参考方法[3]，该法准确可靠，但LC梯度洗脱时间为40 min，分析时间大大加长。

本研究建立了一种利用同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱(ID UPLC-MS/MS)检测血清中孕酮浓度的方法。采用两步萃取法,提高了血清样品中孕酮的回收率;使用简单的液相色谱分离，运行时间短，灵敏度高，重现性好。该方法适用于同时检测大批量样品，为临床血清中激素的检测提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity 超高效液相色谱仪、Xevo TQ-XS 三重四极杆串联质谱仪(美国Waters公司)；涡旋混合仪(MS 3 basic，德国IKA公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；氮吹仪(艾杰尔飞诺美公司)；分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；可调量程移液器(0.5～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL，德国Eppendorf公司)；Milli-Q Reference超纯水系统(美国Millipore 公司)。

孕酮标准品(99.2%，中国计量科学研究院)；孕酮-D9同位素标准品(98%，美国CFW实验室);甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；正己烷、乙酸乙酯(HPLC级，天津康科德科技有限公司)；30%氨水(LC-MS级，美国Waters公司)；乙酸铵、碳酸钠(优级纯，福晨化学试剂有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 样品来源

血清样品来自天津市公安医院门诊及住院患者，样本的收集及使用已取得医院许可并符合相关规定，患者血清样本共30例，外观澄清，无溶血、黄疸及脂血，于-80 ℃冷冻保存。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取适量(精确至10.00 mg)的孕酮和孕酮-D9标准物质，用甲醇配制成质量浓度为1.0 μg/mL的标准储备液和内标储备液，-20 ℃保存。

准确移取适量内标储备液，用甲醇稀释成10 ng/mL的同位素内标工作溶液，-20 ℃保存。

准确移取适量孕酮标准储备液，用甲醇稀释成质量浓度分别为10、25、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 pg/mL的系列标准工作溶液；将10 μL同位素内标工作溶液加入100 μL各系列标准工作溶液中，-20 ℃保存。

1.4 样品制备

移取10 μL孕酮-D9内标工作溶液至1.5 mL离心管中，用氮气将溶剂吹干，在离心管中分别加入100 μL血清样品和100 μL乙酸铵(0.5 mol/L)，并在室温下平衡1 h；用500 μL乙酸乙酯-正己烷(体积比3∶2)进行液液萃取(LLE)，涡旋振荡10 min，13 000 r/min离心2 min后，取上清液以40 ℃氮气吹干；向离心管中加入200 μL碳酸钠(0.2 mol/L)，再依次加入500 μL正己烷萃取2次，13 000 r/min离心5 min后，合并两次提取上清液，以40 ℃氮气吹干，加100 μL甲醇进行复溶，待上机分析。

1.5 UPLC-MS/MS测定条件

1.5.1 色谱条件Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm；美国Waters公司)；流动相：A为0.1%(体积分数)氨水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～0.5 min，40%B；0.5～2.5 min，40%～10%B；2.5～3.5 min，10%B；3.5～3.6 min，10%～40%B；3.6～5.0 min，40%B。流速：0.4 mL/min，柱温：45 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量：5 μL。

1.5.2 质谱条件电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；多反应监测(MRM)扫描模式；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为150 ℃；脱溶剂气(高纯N2)：温度为500 ℃，流量为1 000 L/h；锥孔反吹气(高纯N2)流量为150 L/h；碰撞气为高纯Ar。目标物的监测离子对(m/z)、锥孔电压、碰撞电压等质谱参数见表1。

表1 孕酮及其同位素的质谱分析条件Table 1 Optimized MS/MS parameters for progesterone and progesterone-D9

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法的优化

血清样品常用的前处理方法包括蛋白沉淀、固相萃取(SPE)、LLE萃取等。孕酮的质谱检测文献中，大多采用正己烷对样品进行LLE萃取[3,15-16]。为有效去除脂质干扰，本实验采用两步LLE萃取对样品进行净化，第一步使用乙酸乙酯-正己烷(3∶2)对孕酮进行提取；第二步加入碳酸钠去除样品中的极性脂质物质，再用正己烷反复萃取2次。该净化步骤有效降低了杂质干扰，提高了血清样品中孕酮的回收率。同时，由于用甲醇作溶剂，内标溶液的加入会使血清蛋白局部产生沉淀，为消除沉淀的影响，本实验在加样前用氮气将溶剂吹干。以乙酸铵作解离剂能将孕酮与结合蛋白完全解离，同时避免了内标物与蛋白的结合，消除内标物与分析物回收率的不完全平衡，从而使分析物的回收率趋于一致，提高检测的精密度。优化后的处理方法，可使样品的绝对回收率达到80%。

2.2 流动相的选择

首先考察了甲醇和乙腈作为流动相时的分离效果和响应信号，结果显示采用乙腈为流动相时，孕酮和孕酮-D9的峰形较差，保留时间靠前；甲醇为流动相时的背景干扰小，孕酮和孕酮-D9均能获得理想的峰形，且响应信号明显较乙腈作为流动相时高，这可能是由于甲醇作为流动相时待测物的离子化效率更高，因此选择甲醇-水作为流动相。另比较了0.1%氨水溶液和10 mmol/L乙酸铵溶液两种水相溶液与甲醇组合的流动相体系的分离效果和灵敏度，发现以0.1%氨水溶液作水相时，孕酮的响应值较高，分离效果和灵敏度较好。因此，流动相确定为0.1%氨水溶液和甲醇。在“1.5”条件下，孕酮和同位素标准品的MRM色谱图见图1。

图1 孕酮及同位素标准品的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of progesterone and progesterone-D9 standards

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应基质效应(ME)是指样品中的背景杂质对目标物质谱信号的影响(增强或抑制)，通常通过比较目标物在基质和空白溶剂中的响应信号进行评价[16]。用空白溶剂(甲醇)分别配制低、中、高质量浓度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的标准溶液并添加内标工作溶液，提取制得标准溶液a；取真实血清样品，分别添加低、中、高质量浓度水平的孕酮标准溶液及10 μL内标工作溶液(10 ng/mL)，提取制得基质样品b；取相同的血清样品添加内标工作溶液，提取制得基质对照样品c。对样品和标准溶液进行质谱测定，参照Botelho方法[18]进行计算，ME%=(Rb-Rc)/Ra×100%，其中R为样品或标准溶液中孕酮和内标响应信号的比值。一般认为，当ME值接近100%时，表明不存在基质效应的影响。结果显示本方法的ME平均值为95.20%，表明样品基质对孕酮的质谱响应无明显影响。

2.3.2 线性关系、检出限与定量下限采用同位素内标法进行定量，取“1.3”系列标准工作溶液各100 μL,加入10 μL孕酮-D9内标工作溶液，在优化条件下进行测定，以标准溶液定量离子峰面积与内标物定量离子峰面积的比值(y)为纵坐标，标准溶液的质量浓度(x,pg/mL)为横坐标进行线性回归，并计算血清中待测物的浓度。结果显示，孕酮在10～10 000 pg/mL质量浓度范围内线性关系良好(r2=0.999 8)，回归方程为y=1.104x+34.013；系列标准溶液中内标物定量离子的峰面积稳定，RSD为7.9%。按信噪比(S/N)为3的质量浓度确定检出限(LOD)为5 pg/mL，S/N为10的质量浓度确定定量下限(LOQ)为10 pg/mL。

2.3.3 回收率与相对标准偏差取10 μL内标工作溶液于1.5 mL离心管中，加入0.1 mL空白血清基质，分别配制低、中、高3种质量浓度(0.05、0.5、5.0 ng/mL)的质量控制(QC)样品。每个浓度平行制备6份，按照本方法进行提取与测定，并计算平均回收率和日内RSD;连续测定3 d，计算日间 RSD。结果表明，孕酮的平均回收率为91.5%～106%，日内RSD和日间RSD均在10%以内(表2)，符合生物样品分析要求。

表2 血清中孕酮的回收率及精密度Table 2 Recoveries and precisions of progesterone in serum

2.3.4 样品稳定性制备低、中、高3种质量浓度水平(0.378、4.510、5.872 ng/mL)的血清样品，分别考察了其在室温下放置4 h、样品提取后提取物于4 ℃储存24 h、3个冻融循环后的稳定性。以6次测定的平均值为样品实际浓度，结果显示孕酮的响应值变化低于15%，表明样品在以上3种条件下均可稳定储存。