高效液相色谱法测定蔬菜中19种氨基甲酸酯类农药的残留量

氨基甲酸酯类农药是人类针对有机氯和有机磷农药的缺点而开发出的一种新型广谱杀虫、杀螨的除草剂，具有高效、低毒、选择性高和持效期长等特点，主要用于粮食、蔬菜和水果等农产品和中药材栽培中，在我国使用越来越普遍[1-3]。然而，若不对氨基甲酸酯类农药的使用进行监控，任其随意使用，就会造成人、畜中毒事件，其残留对人、畜和环境都会产生极大的危害[4]。因此，许多国家和地区对这种农药在食物中的残留量都制定了严格的限量标准。欧盟规定蔬菜中克百威的最高残留量为0.02 mg·kg－1，呋线威的最高残留量为0.05 mg·kg－1；我国规定涕灭威(包括涕灭威、涕灭威亚砜和涕灭威砜)在大部分蔬菜中的残留限量为0.03 mg·kg－1，灭多威在蔬菜中的残留限量为0.2 mg·kg－1。这就使得氨基甲酸酯类农药的测定倍受关注[5]。

目前，氨基甲酸酯类农药残留量的测定方法主要有液相色谱-质谱法[6-9]、使用柱后衍生-荧光检测器的高效液相色谱法[10-11]、使用紫外检测器的高效液相色谱法[12]和气相色谱-质谱法[13]。

由于液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法要用到价格高昂的测定设备，一般基层检测机构难以满足，而使用紫外检测器的高效液相色谱法所能测定的氨基甲酸酯类农药的种类偏少。因此，使用柱后衍生-荧光检测器的高效液相色谱法是基层检测机构中较常用的测定氨基甲酸酯类农药残留量的方法。文献[4]采用超快速高效液相色谱法测定普通白菜中16种氨基甲酸酯类农药残留量；文献[14]建立了高效液相色谱法(柱后衍生)测定蔬菜、水果中的15种氨基甲酸酯类农药残留量的方法；文献[15]建立了测定蔬菜和水果中常见的21种氨基甲酸酯类农药残留量的液相色谱法(使用柱后衍生-荧光检测器)，而真正能实现分离的是18种氨基甲酸酯类农药。所报道的文献中，要么对仪器设备要求较高，有些还是自制，要么所测定的氨基甲酸酯类农药的种类不够多。

本工作采用高效液相色谱法测定蔬菜中涕灭威亚砜、涕灭威砜、杀线威、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、残杀威、克百威、甲萘威、灭杀威、乙硫苯威、硫双威、抗蚜威、异丙威、仲丁威、甲硫威、猛杀威和呋线威等19 种氨基甲酸酯类农药的残留量，所用到的仪器设备都是基层检测机构所能普遍达到的，为基层检测机构开展相关方面的研究提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色谱仪，配G1310B型四元泵、G1329B 型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1321B 型荧光检测器和PICKERING型柱后衍生装置；Milli-Q Intrgral型水纯化系统；Auto EVA-60型全自动平行浓缩仪；B-400型均质器；T25 型 高 速 匀 浆 机；12 位 固 相 萃 取 装 置；0.22μm 有机相针式滤膜过滤头；SPE-NH2固相萃取小柱(500 mg/6 m L)；Qu ECh ERs净化柱。

杀线威、灭杀威、乙硫苯威、猛杀威和呋线威标准储备溶液:100 mg·L－1。

涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、残杀威、克百威、甲萘威、硫双威、抗蚜威、异丙威、仲丁威、甲硫威标准储备溶液:1 000 mg·L－1。

19种氨基甲酸酯类农药的混合标准储备溶液:10 mg·L－1，分别移取适量的上述19种氨基甲酸酯类农药的标准储备溶液，用甲醇稀释混合而成，冷冻避光保存。

邻苯二甲醛(OPA)试剂:将100 mg OPA 和2 g巯基乙醇用适量水溶解后转移至已去氧的OPA稀释剂中，混合而成。

甲醇、二氯甲烷、乙腈均为色谱纯；氯化钠为分析纯；试验用水为超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

1)衍生条件 水解试剂流量0.3 m L·min－1，OPA 试剂流量0.3 m L·min－1；水解温度100 ℃，衍生温度为室温。

2)色谱条件 PICKERING Carbamate Analysis-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱温42 ℃；流量0.8 m L·min－1；进样量20μL。流动相:A 为甲醇，B为水。梯度洗脱程序:0～12.0 min时，B 由80%降 至60%；12.0～20.0 min 时，B 由60%降至50%；20.0～30.0 min时，B 由50%降至41%，保持5.0 min；35.0～40.0 min时，B由41%降至0，保持6.0 min；46.0～46.1 min时，B 由0升至80%，保持5.9 min。抗蚜威的激发波长(λex)为339 nm，发射波长(λem)为392 nm，其余18种氨基甲酸酯类农药的λex为339 nm，λem为445 nm。

1.3 试验方法

样品经均质机均质后，称取约25 g均质后样品于150 m L烧杯中，加入50 m L乙腈提取，高速匀浆机匀浆2 min，然后经快速滤纸过滤到已有5 g氯化钠的100 m L比色管中，收集滤液。过滤完后，滤液涡旋混匀1 min，静置分层。取上清液10 m L 置于全自动平行浓缩仪中吹至近干。

用6 m L 的1%(体积分数，下同)甲醇-二氯甲烷混合液预淋洗SPE-NH2固相萃取小柱，用2 m L的1%甲醇-二氯甲烷混合液溶解残渣，上样，再用2 m L的1%甲醇-二氯甲烷混合液分2次溶解残渣上样，收集洗脱液，氮吹至近干。残留物用60%(体积分数，下同)甲醇溶液定容至2.5 m L，过0.22μm有机滤膜后，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

19种氨基甲酸酯类农药的混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 19种氨基甲酸酯类农药的混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of 19 carbamate pesticides

2.2 仪器工作条件的选择

2.2.1 流动相

试验采用PICKERING Carbamate Analysis-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)进行分离，考察了乙腈-水体系和甲醇-水体系作为流动相时对19种氨基甲酸酯类农药测定的影响。结果表明:乙腈-水体系作为流动相时，19种氨基甲酸酯类农药的荧光值比甲醇-水体系为流动相时19种氨基甲酸酯类农药的荧光值大很多，但是乙腈-水体系作为流动相时，通过不断改变流动相比例，不能很好地分离残杀威、克百威、甲萘威、灭杀威、乙硫苯威、硫双威和抗蚜威。因此，试验选用甲醇-水体系作为流动相，通过改变流动相比例，能够在46 min内将19种氨基甲酸酯类农药进行分离，梯度洗脱程序见1.2节。

2.2.2 流 量

试验考察了流量依次为0.8，1.0 m L·min－1时对19种氨基甲酸酯类农药测定的影响。试验发现:流量为1.0 m L·min－1时，硫双威不能与抗蚜威分离开，仲丁威和甲硫威不能达到基线分离。试验选择流量为0.8 m L·min－1。

2.2.3 柱 温

试验考察了柱温依次为35，42，46℃时对19种氨基甲酸酯类农药测定的影响。试验发现:柱温为46 ℃时，残杀威与克百威、仲丁威与甲硫威不能基线分离，硫双威与抗蚜威分得较开；柱温为35℃时，残杀威与克百威、仲丁威与甲硫威分得较开，而硫双威与抗蚜威不能分离，变成了一个峰。试验选择柱温为42 ℃。

2.2.4 测定波长

试验考察了λex＝330 nm，λem＝465 nm 和λex＝339 nm，λem＝445 nm 时对19种氨基甲酸酯类农药测定的影响。试验发现:在λex＝339 nm，λem＝445 nm 时，19种氨基甲酸酯类农药的荧光值比在λex＝330 nm，λem＝465 nm 时的19种氨基甲酸酯类农药的荧光值大。因此，试验选择测定波长为λex＝339 nm，λem＝445 nm。然而在试验中也发现，抗蚜威在此测定波长下荧光值较低。文献[16]中，抗蚜威的最佳测定波长为λex＝317 nm，λem＝392 nm，然而在λex＝317 nm，λem＝392 nm 下，其他氨基甲酸酯类农药的荧光值很低。为了确定最佳的测定波长，试验采用多发射方案。试验发现:抗蚜威在λex＝339 nm，λem＝392 nm 下的荧光值比在λex＝339 nm，λem＝445 nm 下的荧光值大了3 倍左右。试验中抗蚜威选择λex＝339 nm，λem＝392 nm，其余18种氨基甲酸酯类农药选择λex＝339 nm，λem＝445 nm。

2.3 样品前处理方法

试验考察了SPE-NH2固相萃取小柱净化和Qu ECh ERs净化对19种氨基甲酸酯类农药测定的影响。SPE-NH2固相萃取小柱的净化方法见1.3节。Qu ECh ERs 净 化 方 法 按 以 下 来 操 作:将10 m L乙腈提取液倒入Qu ECh ERs净化包中，涡旋混匀1 min，以5 000 r·min－1转速离心，移取6 m L上清液，氮吹至近干，用60% 甲醇溶液定容至1.5 m L，过0.22μm 有机滤膜，按仪器工作条件进行测定。通过试验发现，SPE-NH2固相萃取小柱净化的回收率要明显高于Qu ECh ERs净化的回收率。试验选用传统的SPE-NH2固相萃取小柱净化。

2.4 标准曲线和检出限

用60%甲醇溶液将10 mg·L－1的19种氨基甲酸酯类农药的混合标准储备溶液逐级稀释成0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg·L－1的 混 合 标 准 溶液系列。按试验方法对上述混合标准溶液系列进行测定，以19种氨基甲酸酯类农药的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。19种氨基甲酸酯类农药的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，结果见表1。

表1 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

表1(续)

2.5 回收试验

按试验方法对空白花菜样品进行加标回收试验，平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of test for recovery(n＝6)

表2(续)

由表2可知:回收率为47.7%～110%，RSD 为1.0%～12%。本方法能满足蔬菜中19种氨基甲酸酯类农药残留量的测定要求，其中乙硫苯威的回收率普遍偏低，主要原因是乙硫苯威在前处理过程中，容易转变成另外一个未知物质，该物质有待进一步研究。

空白花菜样品加标前后的色谱图见图2。

图2 空白花菜样品加标前后的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank cauliflower sample before and after addition of standard

2.6 样品分析

按试验方法对菠菜、生菜、蒲瓜、甘薯、韭菜、大白菜、黄瓜、四季豆、彩椒、辣椒、苦瓜、荷兰豆、皇帝菜等样品进行分析，均未检出19 种氨基甲酸酯类农药。

本工作以乙腈为提取溶剂，选用SPE-NH2固相萃取小柱净化，采用高效液相色谱法测定蔬菜中19种氨基甲酸酯类农药。本方法测定范围广、分离度高、简便、灵敏、高效，可满足蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留量的测定需求。