采用Mini-Flotac 和PCR 方法检测圈养野生动物肠道寄生虫

范克伟，张 宁,，孙晓双,，杨 飞,3，魏 涛，陈小丽，唐 耀，傅文源，陈腾腾，陈志颖，刘佳悦，吴 然，黄翠琴*，周东辉*

（1. 龙岩学院生命科学学院/福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建 龙岩 364012；2.福建农林大学动物科学学院/福建省动物药物工程实验室，福建 福州 350002；3. 西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；4. 福州市动物园管理处，福建 福州 350012；5. 福建梅花山华南虎繁育研究所，福建 龙岩 364201）

近年来，野生动物的疾病研究呈上升趋势，而越来越多的研究显示寄生虫病是危害野生动物的主要疾病之一。寄生于动物肠道的寄生虫种类主要有线虫、吸虫、绦虫和原虫，直接凭借形态通过显微镜观察可有效地检测到直径较大的寄生虫虫卵或卵囊，但一些虫体微小的原虫，如芽囊原虫（Blastocystis.sp），其空泡型平均直径仅为4 μm～15 μm[1]，利用传统的形态学检测方法敏感度较差，目前主要是利用分子生物学的方法进行检测与鉴定。近期的研究发现，珍稀野生动物在人和动物的芽囊原虫感染过程中具有公共卫生隐患[2]。

福建地区具有丰富的野生动物资源，本研究通过采用Mini-Flotac 对福建圈养野生动物粪便进行寄生虫虫卵或卵囊检测，并采用基于SSU rRNA 基因序列的PCR 检测对福建地区于野生动物芽囊原虫进行种群结构分析，旨在了解福建地区圈养野生动物肠道寄生虫感染情况，并评估人兽共患风险，以期为有效防治野生动物寄生虫病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存 2018年3月至4月，分别在福建省梅花山华南虎繁育研究所和福州市动物园共采集70 份新鲜粪样（含28 种野生动物），每份约20 g，置于一次性塑料袋中，并标注动物种类、收集地点及日期。每份样品分装成两份，一份直接存放于4 ℃，用于Mini-Flotac 检测，一份置于2.5%的重铬酸钾溶液后存放于4 ℃保存，用于分子检测。

1.2 主要试剂 饱和NaCl 溶液和粪便基因组E.Z.N.A®DNA 提取试剂盒购自OMEGA 公司；rTaq DNA 酶、10×rTaq buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2购自北京全式金生物技术有限公司；6×Loading Buffer和DL 2000 DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Mini-Flotac kit 购自意大利那不勒斯菲里德里克第二大学（University of Naples Federico II）动物医学学院寄生虫学和寄生虫病系。

1.3 Mini-Flotac 检测粪便寄生虫 按照Mini-Flotac kit 说 明（www.parassitologia.unina.it）进 行 组 件 装配，样品处理及实验操作。对两个计数室的卵囊数量进行计数，采用公式OPG/EPG=两个计数室里的卵囊个数之和×10，即可得到每克粪便中的卵囊数或虫卵数。

1.4 粪便样品基因组DNA 提取 每份粪便取200 mg置于2 mL 离心管中，加入双蒸水，混匀，12 000 r/min离心1 min，弃上清，重复步骤至清洗干净表面的重铬酸钾；将含有粪便样品的离心管置于100 ℃水浴中静置5 min 后置于-80 ℃5 min，反复冻融5 次后，按照粪便基因组提取试剂盒说明书提取DNA后置于-20 ℃保存待用。

1.5 PCR 扩增及测序 参照文献[3]PCR 扩增芽囊原虫小亚基核糖体RNA（SSU rRNA），PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化后由广州擎科生物技术有限公司进行双向测序。

1.6 SSU rRNA 序列分析及种系发育分析 应用Clustal X 1.83 将测序获得的两条正反互补核苷酸序列进行比对校正，获得校正的完整序列，拼接的完整序列在NCBI 的Blast 上进行相似性搜索，下载同源性最高的序列与获得的序列进行比对，确定序列是否是芽囊原虫的基因组，分析序列差异。利用Mega5.0 软件，选择邻接法（Neighbor-joining，NJ 法）中的Kimura-2-parameter 模型，构建系统发育树。进化树的可靠性用Bootstrap 分析进行检测，进行1 000 个重复。

2 结果与讨论

2.1 野生动物肠道寄生虫感染率及感染强度Mini-Flotac 检测结果显示，27 种野生动物共70 份新鲜粪便样品中，有42 份为寄生虫阳性粪便样品，总感染率为60.00%，最低感染强度（EPG 或OPG 值）为100，最高达34 800，表明福建地区野生动物肠道寄生虫感染较严重。其中灵长类动物感染率为56.25%（9/16），松鼠猴的感染较为严重，主要为线虫与球虫混合感染，线虫虫卵EPG 值达2000，其它灵长类动物以球虫感染为主；食肉目动物感染率为38.46%（5/13），1 份华南虎粪便为等孢球虫类[4]和线虫混合感染，1 份为线虫感染，感染强度均较高（球虫OPG 达9150，线虫EPG 达9 600），其它食肉目动物均为球虫感染；禽类动物感染率为50.00%（8/16），均为球虫感染，其中雉鸡感染球虫OPG 值高达34 800；偶蹄目动物感染率为81.82%（18/22），以梅花鹿感染最为严重（88.24%，15/17），最高OPG 值达8750；奇蹄目动物球虫感染率为100.00%（3/3），最高OPG 值为9 600，各种动物肠道寄生虫感染率和感染强度见表1。这些数据表明，寄生虫病是危害野生动物的主要疾病之一，应定期监测和制定科学合理的驱虫方案。

表1 福建部分圈养野生动物肠道寄生虫感染率及感染强度Table 1 Infection rates and intensity of intestinal parasites in part of wild animals from Fujian province

续表

Barda 等通过3 种方法对肠道寄生虫进行检测，发现Mini-Flotac 是蠕虫感染最敏感的检测方法，也是一种有效、敏感且成本低廉的替代技术[5]。Mini-Flotac 检测方法的优点在于时间上更加的高效，操作流程更加的便捷，对虫卵的鉴定也更加的准确，最主要的优点是可在400 倍显微镜下观察，其材质为聚碳酸酯无定形热塑性塑料，不易将其打碎造成不必要的损失，且该装置是圆形封闭式的装置，置于显微镜下时，液体不易溢出污染显微镜台。本研究在国内首次采用Mini-Flotac 对福建圈养野生动物进行粪便漂浮法检查。

2.2 粪便中芽囊原虫SSU rRNA 基因的PCR 扩增结果 70 份野生动物粪便样品中，扩增出10 份约为600 bp 的阳性样品（图1），测序结果显示，扩增出的10 份样品均为芽囊原虫阳性样品，总感染率为14.29%（10/70），阳性样品分别来源于7 份梅花鹿、1 份赤猴、1 份孔雀和1 份猕猴，表明这些野生动物存在芽囊原虫感染。

图1 部分野生动物粪便中芽囊原虫PCR 鉴定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification for Blastocystissp.SSU rRNA of part of wildlife faecal samples

2.3 芽囊原虫SSU rRNA 的序列分析及亚型分布通过序列比对拼接，10 个阳性序列归类为5 个不同的序列，上传至NCBI 数据库，获得登录号为MK357782～MK357786，并构建了SSU rRNA 基因序列的进化树。结果显示，本研究获得的10 个芽囊原虫阳性分离株处于5 个不同的分支，分布于5 种不同基因亚型（图2），其中7 份梅花鹿源芽囊原虫中，1 份属于ST 14 亚型，6 份为ST 10，表明芽囊原虫ST 10 在梅花鹿中感染普遍，这与其它文献[6]中报道的ST10 为偶蹄动物的优势亚型一致。其它芽囊原虫样品中，赤猴源为ST 3 亚型、孔雀源为ST 6 亚型、猕猴源为ST 1 亚型。这些亚型中，ST1、ST3 和ST6 为人兽共患亚型，其中ST1 在非人类灵长类中感染最多，ST10 和ST14 为动物特异性亚型[6]。

图2 基于SSU rRNA基因片段的芽囊原虫亚型NJ系统进化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Blastocystis subtypes based on the SSU rRNA gene fragment using the neighbor-joining method

研究分析表明，福建地区野生动物芽囊原虫存在人兽共患亚型，因此需要采集更多的样品进行检测，进一步分析该地区和不同种类的野生动物芽囊原虫种群结构，确定该原虫最初是人源还是动物源[6]，为其防治提供更科学的参考依据。

本次检测结果显示福建地区野生动物主要感染的肠道寄生虫为原虫类和线虫类，其中原虫类感染最为严重，可采用氨丙啉、妥曲珠利、磺胺类药等药物进行驱虫；其次为线虫感染，可采用左咪唑、阿苯达唑、丙硫咪唑、阿维菌素等药物进行驱虫，同时应加强圈养野生动物的地面，圈舍的消毒，及时处理野生动物产生的粪便，防止投喂的食物接触粪便，做好防鼠措施，避免鼠，猫窜入圈舍，容易导致寄生虫的传播和感染。此外，本次调查结果表明，福建省野生动物芽囊原虫存在人兽共患风险，在饲养和接触过程中应当注意防范，加强环境卫生和个人卫生，防止食源性污染是降低感染的有效途径。