一株鸭源维氏气单胞菌的分离鉴定与致病性的初步研究

苏 湘，仲 艳，王希玉，秦 涛，陈素娟*，彭大新

（1. 扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225000；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225000）

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii，A. veronii）广泛存在于水体和土壤中，绝大多数菌株是动物肠道与自然生态系统的正常菌群[1]，而一些致病性菌株，是较为新型的人-兽-水生生物共患病原菌，近年来，感染A.veronii 的病例报道越来越多，可以引起多种鱼类如锦鲤、罗非鱼等大量死亡[2]，也可感染一些特殊的水生生物，如大鲵[3]等，偶尔也会感染恒温动物，如狐狸感染后会出现剧烈腹泻，重者死亡[4]；兔感染后出现呼吸道疾病临床症状[5]；人类感染后会出现毒血症[6]、心内膜炎[7]等症状，尤其是免疫力低下的人群，一旦感染将有死亡的风险[8]。A.veronii可污染畜禽肉品、蔬菜和水产品等，给养殖业带来严重的经济损失，同时也严重威胁着人类的健康[9]。

2018 年12 月，江苏某肉鸭养殖场30 周龄的种鸭突然出现散发性死亡，病死鸭的主要病理变化表现为肝脏不同程度的出血坏死；心肌出血和脑充血出血等，为确诊该病，进行了病原的分离鉴定，分离到一株鸭源A.veronii，并对其生物学特性和致病性展开了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 病料样品及主要实验材料 江苏某养殖场死亡种鸭，30 周龄，大多注射部位感染；饲养期间未用药，但曾注射肝炎弱毒苗、浆膜炎、禽流感、鸭瘟、坦布苏、新城疫疫苗；细菌生化管和药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；麦康凯、LB 和血琼脂培养基自行配制；绵羊全血购自郑州九龙生物制品有限公司。6 周龄BALB/c 小鼠购自扬州大学比较医学中心；2 日龄健康雏鸭，购自泰兴丽佳禽业有限公司。

1.2 病鸭的解剖观察 剖检死亡鸭，观察内脏的病变，并拍照记录。

1.3 病毒检测 研磨病料样品，进行禽流感病毒、新城疫病毒及黄病毒等的检测。

1.4 细菌的分离培养及形态观察 无菌采集病鸭肝脏，分别接种于血平板、麦康凯培养基和LB 培养基中，37 ℃培养24 h。挑取单菌落进行纯培养，经革兰染色，镜检，观察菌体形态。

1.5 微生物质谱仪鉴定 对分离菌进行微生物质谱分析，初步鉴定分离菌的种属。

1.6 细菌的生化鉴定 挑取纯化后的单菌落至LB液体培养基中过夜培养，接种于微量生化反应管，37 ℃条件下培养18 h～24 h，观察反应结果，初步鉴定分离菌的生化特性。

1.7 细菌16S rRNA 基因序列分析 通过煮沸裂解法制备细菌模板DNA，利用16S rRNA 引物进行PCR扩增，参考文献[10]设计引物（5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR 反应条件：95 ℃3 min；95 ℃15 s、53 ℃15 s、72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，测序。

1.8 药敏试验 采取K-B 药敏纸片扩散法[11]对分离株进行19 种常用抗生素的药敏试验。参考杭州天和微生物试剂有限公司《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》判断该菌对不同药物的敏感性。

1.9 雏鸭人工感染试验 分离菌于37 ℃血琼脂培养6 h，比浊法测定菌液浓度。选取2 日龄雏鸭通过腹腔分别注射1.0×1010cfu 和1.0×1011cfu 细菌。观察并记录其发病死亡情况，如出现死亡则立即解剖。

1.10 小鼠的致病性试验 挑取分离纯化的单菌落于血液琼脂培养皿，37 ℃培养6 h。分别通过比浊法测定菌液浓度，用15%甘油PBS 稀释至1.0×106cfu/mL～1.0×109cfu/mL。健康小鼠随机分为5 组，感染组4 组每组各4 只，对照组3 只。其中攻毒组于腹腔注射菌液悬液（0.5 mL/只），对照组于腹腔注射等量的15%甘油PBS。若发现死亡则立即解剖，并对致病菌分离鉴定，用改良寇氏法计算细菌的半数致死量（LD50）[12]。

2 结果与讨论

2.1 死亡鸭的病理解剖 剖检死亡鸭，肉眼可观察到组织器官病变主要为肝脏表面颜色不均、多发性坏死灶，脑血管充血、出血，心冠脂肪及心肌出血。

2.2 病毒检测 未检测到相关病毒。

2.3 细菌的分离培养与染色镜检 麦康凯和LB 培养基表面可见圆形菌落，其表面光滑，边缘整齐，不透明，灰白色，中央稍凸起；血琼脂培养基出现明显的β溶血（图1）。革兰染色镜检可见红色两端钝圆的短直阴性杆菌，多为单个或成双存在。表明，该分离菌为β溶血阴性杆菌。

2.4 分离菌的微生物质谱仪鉴定 微生物质谱分析结果显示，分离菌的鉴定值为2.053，介于2.000～2.299 之间，结果对照判定标准，初步判定该分离菌属于气单胞菌属。

图1 血平板分离与培养结果Fig.1 The results of isolation and culture in blood agar medium

2.5 分离菌生化鉴定 生化试验结果显示蛋白胨水（靛基质）、枸橼酸钠、赖氨酸、M-R、V-P 试验反应阳性；硫化氢、苯丙氨酸、尿素、鸟氨酸、葡萄糖盐酸、赖氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木糖、氨基酸对照反应均呈阴性。参照《伯杰细菌鉴定手册》，结果显示该菌符合A.veronii的生化特性。

2.6 16S rRNA 基因序列分析 16S rRNA 试验结果显示，约1 400 bp 处出现特异性目的条带（图2）。测序结果显示，分离株的基因序列与GenBank 中已登录的多个A. veronii 基因序列相似度均为99 %以上，表明该分离菌为A.veronii。因此，本试验首次从病死鸭体内分离到了A.veronii，以往未见相关报道。

2.7 药敏试验 药敏试验结果显示，分离菌对氟苯尼考等10 种药物敏感，对红霉素等6 种药物中度敏感，对四环素等3 种药物耐药（表1）。通过药敏试验，能准确筛选出病原菌的敏感药物，可以大幅降低抗生素用量，具有重要意义。但是部分药物已被禁止在家禽养殖中使用[13]，所以选取药物时既要考虑药物的敏感性，又要遵循用药的规定，因此建议选用庆大霉素、头孢氨苄等药物来治疗疾病。

图2 16S rRNA PCR 扩增凝胶电泳图Fig.2 PCR products of 16S rRNA gene from the strain

表1 分离菌的药物敏感性结果Table 1 Antibiotic sensitivity test of the isolated bacteria

2.8 雏鸭人工感染试验结果 将分离菌制备成悬菌液，腹腔注射2 日龄雏鸭，结果表明，24 h 内，1011cfu 组4 只雏鸭全部死亡，1010cfu组死亡3只，对照组未出现死亡。剖检可见腹部皮下呈胶冻样，肠道鼓气，腹腔炎性渗出，心肌松弛、心脏出血，肝脏出血等病变。病鸭肝脏中分离出细菌，于血平板上呈现明显的β溶血，经鉴定为A.veronii。表明A.veronii可造成雏鸭死亡。据此推测该病例中种鸭死亡的原因可能为体表伤口接触含有A. veronii 的土壤和水源或采食感染A.veronii 的鱼、虾以及其他水生生物导致死亡。

2.9 小鼠致病性试验 菌液腹腔注射小鼠，结果表明，5.0×107cfu 和5.0×108cfu 组小鼠于腹腔注射后1 d～2 d 内全部死亡；其余小鼠在两周内正常存活（表2）。通过改良寇氏法计算细菌的LD50为5.0×106.5cfu。对死亡小鼠解剖，可见肝脏、肺脏出血明显。表明A.veronii 对小鼠有一定的致病性。李伟杰、周军等均首次证明A.veronii 对狐狸、家兔等哺乳动物有较强的致病性，与本试验结果相似[4-5]。

表2 小鼠致病性试验结果Table 2 Pathogenicity of the strain to mice