宿主细胞粘附相关基因表达与鸡传染性喉气管炎病毒组织嗜性相关性的研究

2020-06-01谭克龙宫爱艳

中国预防兽医学报 2020年2期

谭克龙，宫爱艳

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

鸡传染性喉气管炎（Avian infectious laryngotracheitis，AILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis，ILTV）感染引发鸡的一种急性、接触性呼吸系统疾病。ILTV 属于疱疹病毒科、传喉炎病毒属。该病毒传播速度快，感染率高达95%～100%，感染后难以清除。该病的致死率根据ILTV毒力不同以及鸡只个体免疫力差异从10%～70%不等，ILTV 可感染所有年龄的蛋、肉、种用家禽，严重影响鸡只的生产性能，是一种危害世界养禽业发展的重要传染病[1]。当前，防治AILT 主要依赖活病毒疫苗激发的宿主免疫应答。然而，现有疫苗免疫保护力不强，ILTV 疫苗免疫过的鸡场仍然不断爆发新的疫情[2]。基于当前AILT 防疫现状，深入研究ILTV 与宿主互作过程有望为研发安全、长效的AILT免疫制剂提供新思路。

细胞粘附分子能够参与机体多种重要的生理功能和病理过程，如组织细胞间的附着、肿瘤的浸润与转移、各种细胞内信号传导、作为免疫细胞识别的辅助受体和协同活化信号等。已有研究资料显示，粘附分子可以作为特异性结合α疱疹病毒的细胞表面受体，在α疱疹病毒感染宿主的初期参与病毒与宿主细胞的相互识别，进而促进病毒感染过程[3]。其中，钙粘蛋白11（CDH11）和神经生长调节蛋白1（NEGR1）是细胞内重要的细胞粘附分子。CDH11 钙黏附蛋白是一种单链跨膜糖蛋白，在细胞间连接中起到重要作用，可通过TGF-β信号转导调节细胞干性的促凋亡肿瘤抑制子[4-5]。NEGR1 是一种借由GPI锚定在细胞膜表面的蛋白，可通过调控受体酪氨酸激酶相关通路，如FGFR2-ERK 信号通路，调控细胞形态[6-7]。已有研究报道，宿主原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）是ILTV 感染的关键宿主调控因子，可通过调控宿主细胞粘附过程而发挥作用，多功能蛋白聚糖（VCAN）是其互作主要粘附因子[8]。本研究利用ILTV 毒株感染雏鸡，通过ILTV 组织嗜性以及细胞粘附相关基因CDH11、NEGR1和VCAN 的表达水平检测，探索ILTV 感染组织嗜性与细胞粘附分子间的关系，以期为新型免疫制剂的研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株及实验动物 ILTV NP-3 毒株由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离保存；SPF 鸡由新兴大华农禽蛋有限公司提供。

1.2 主要实验试剂 AxyPrep病毒DNA/RNA小量试剂盒购自美国Axygen 公司；One Step PrimeScript®RTPCR Kit Ⅱ（Perfect Real Time）和Premix ExTaqTM（Probe qPCR）购自TakaRa 公司；胶回收试剂盒购自Omega 公司；TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司。

1.3 引物、探针的设计与合成参照文献[8]合成检测编码ILTV gC 糖蛋白基因的特异性引物和探针，以及检测细胞粘附相关基因CDH11、NEGR1 和VCAN 特异性引物（表1），引物和探针由北京六合华大基因有限公司合成。

表1 所用的引物及探针序列Table 1 The primer and probe sequences used in this study

1.4 病毒接种动物及样品采集将6 只28 日龄的SPF 鸡随机分成两组，攻毒组用病毒滴度为10-3.0TCID50的ILTV NP-3 病毒株采用滴鼻方式进行攻毒，剂量为200 μL/只，对照组接种相同剂量的PBS。于攻毒5 d 后（33 日龄），无菌采集两组实验鸡喉头、气管、哈德氏腺、骨髓、腺胃、肺脏、盲肠、脑、盲肠扁桃体、小肠、大肠、肾脏、十二指肠、胰腺、法氏囊、脾脏、胸腺、肝脏等组织样品，-80 ℃冻存备用。

1.5 组织中病毒载量的检测采用AxyPrep 病毒DNA/RNA 小量提取试剂盒提取采集的组织样本总DNA，利用设计的引物ILTV-gC-F/R 及探针ILTVgC-Probe 对各组织中ITLV 病毒载量进行测定。反应程序为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 个循环，计算病毒含量。

1.6 感染ILTV 鸡只各组织中细胞粘附相关基因的表达水平检测采用TRIzol 法提取攻毒组和对照组实验鸡各组织的总RNA，利用One Step PrimeScript®RT-PCR Kit Ⅱ检测各组织中细胞黏附相关基因CDH11、NEGR1 和VCAN 的表达水平。反应程序为：42 ℃5 min， 95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环，以18S RNA 为内参基因，对比分析检测结果，利用SPSS 软件对数据进行统计分析。

1.7 细胞粘附相关基因表达水平与ILTV 组织嗜性相关性分析分别采用相关性分析采用肯德尔相关性系数（Kendall correlation coefficient）和斯皮尔曼相关性系数（Spearman correlation coefficient）检测1.5 和1.6 中两组数据间的相关性，当p＜0.05 时表示差异显著。

2 结果和讨论

2.1 雏鸡攻毒后不同组织中ILTV 载量检测结果利用qPCR 测定SPF 雏鸡感染ILTV 后不同组织中病毒载量情况，结果显示，喉头和气管中ILTV 载量最高，是病毒感染的主要部位；其次在哈德氏腺、骨髓、肺脏、盲肠、脑、盲肠、扁桃体以及小肠样本中也检测到ILTV 的存在，而在大肠、肾脏、十二指肠、胰腺、法氏囊、脾脏、胸腺、肝脏等组织中病毒核酸呈阴性（图1）。以上检测结果表明，ILTV 感染存在明显的组织偏嗜性。

图1 SPF 雏鸡感染ILTV 不同组织中的病毒载量检测结果Fig.1 Detection results of viral load in different tissues about SPF chicks infected with ILTV

2.2 雏鸡攻毒ILTV 后不同组织中细胞粘附相关基因的表达水平检测结果利用RT-qPCR 检测细胞粘附分子CDH11、NEGR1 和VCAN 的基因表达水平。结果显示，在ILTV 阴性组织中，仅胰腺中CDH11表达水平上调，除肝脏中CDH11 表达水平无显著变化外，其它组织中均呈现显著下调；在ILTV 阳性组织中，盲肠和扁桃体中的CDH11 表达水平显著下调，脑和骨髓中的CDH11 表达水平显著上调，而其它组织则变化不显著（图2）。NEGR1 的表达在ILTV阴性组织十二指肠、胰腺、脾脏和肝脏中均未检测到，在肾脏中NEGR1 表达量显著下调；在病毒阳性组织中，NEGR1 仅在骨髓中无表达，在喉头、脑表达下调，其中喉头下调显著。VCAN 的表达除在法氏囊中显著上调外，在其它ILTV 阴性和阳性组织中均无明显变化。以上结果初步表明，雏鸡感染ILTV后CDH11 和NEGR1 的组织表达模式与病毒的组织偏嗜性呈现负相关，而VCAN 的表达与病毒的组织偏嗜性无相关性。

图2 细胞粘附相关基因在不同组织中的表达Fig.2 The expression of cell adhesion related genes in different tissues

2.3 相关基因表达水平与ILTV 的组织分布相关性分析利用SPSS 16.0 软件对影响疱疹病毒感染生物学过程相关基因的表达水平变化与ILTV 的组织分布进行相关性分析，判定标准为0.5≤|r|＜0.8 中度相关，0.3≤|r|＜0.5 低度相关，|r|＜0.3 关系极弱，认为不相关。结果显示，CDH11 的表达水平与ILTV 在各组织分布呈中度正相关，NEGR1 的表达水平变化与ILTV 在各组织分布呈低度正相关，VCAN 的表达水平变化与ILTV 在各组织分布相关性并不显著（表2），提示ILTV 在感染过程中可能需要通过宿主CDH11和NEGR1 调控宿主细胞的代谢、凋亡及细胞骨架等借由细胞粘附分子引发调控的生物学过程来促进病毒的增殖和扩散。Kendall 和Spearman 两种分析方法所得到的相关性结果一致。