IL-17A基因rs2275913位点多态性及血清IL-17A、IgE水平与广西黑衣壮儿童哮喘关系的研究

林娜陆壮念杨丽娟张栋张淑华

(1.右江民族医学院附属医院儿科，广西 百色 533000；2.右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000)

哮喘是儿童时期最常见的气道变应性疾病，以嗜酸性炎症、黏液分泌增多、气道高反应性为特征，主要由辅助性T细胞2(Th2)及其细胞因子IL-4、IL-5、IL-13介导，Th1/Th2失衡是哮喘发生的关键因素，IgE在哮喘发生发展中也发挥重要作用。但近期研究发现[1]包括辅助性T细胞17(Th17)、固有淋巴细胞(ILCs)在内的其他炎性细胞在哮喘的发病过程中也发挥重要作用。IL-17主要由Th17细胞产生，是一种重要的促炎因子，可以促进其他细胞因子如：IL-1β、IL-8、IL-6等炎症因子释放，进而使炎症反应放大，同时也可以刺激机体固有免疫细胞及调节中性粒细胞表达从而发挥促炎作用。在支气管哮喘中，IL-17通过调节固有免疫及招募中性粒细胞至气道上皮细胞，从而促进哮喘发生发展。IL-17A是IL-17家族中最主要的成员，Hasegawa等[2]研究发现在难治性哮喘患者血清中IL-17A表达水平明显升高，说明IL-17A可能参与支气管哮喘的发病发展过程。IL-17A基因rs2275913位点多态性与支气管哮喘的关系也有报道[3]，但结果仍存在争议，本文探讨IL-17A基因rs2275913位点多态性及血清IL-17A、IgE表达水平与广西黑衣壮哮喘儿童关系，报道如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2018年5月—2019年5月在右江民族医学院附属医院就诊的广西黑衣壮哮喘患儿121例，其中男58例，女63例，哮喘诊断符合2016年儿童支气管哮喘诊断标准[4]，患儿1个月内未使用糖皮质激素。选择同期在右江民族医学院附属医院儿童保健科体检115例血生化指标及运动发育均正常的广西黑衣壮健康儿童作为对照组，其中男67例，女48例，无过敏史，家族中无哮喘及其他免疫性疾病患者。两组受试者祖辈三代以上均为广西黑衣壮，相互之间无血缘关系。两组间年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05) 。本研究已获得我院医学伦理委员会批准，研究对象和/或监护人已知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 采集研究对象空腹外周静脉血4 ml，2 ml放于EDTA抗凝管中，用于提取DNA；2 ml存放于生化采血管，室温静置1 h后离心10 min(条件：3000 r/min)，将上清液转移至2个EP管中，分别用于血清IL-17A及IgE水平测定。所有标本放置-80℃冰箱保存待检。

1.2.2 IL-17A血清水平测定 采用双抗体夹心ELISA法检测，严格按照人IL-17A ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 血清IgE水平测定 采用全自动生化分析仪测定标本血清IgE水平，由我院检验科协助完成。

1.2.4 DNA提取 严格按照离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒里描述的步骤提取DNA。

1.2.5 引物的合成 通过primer3在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计引物，由捷瑞生物工程(上海)股份有限公司进行合成，扩增rs2275913位点的引物(见表1)。

表1 rs2275913位点的引物序列

1.2.6 PCR反应和基因测序 ①PCR扩增：采用15 μl反应体系，其中包括2.0 μl模板DNA，10×Buffer 1.5 μl 、Mg2+1.5 μl、1 U Taq酶、0.3 μl dNTP、1 μl多重PCR引物，剩余的体积用双蒸水补足至15 μl，充分混匀，离心，上PCR仪(东胜龙黑金刚EDC-810 PCR仪)。PCR反应程序：95℃预变性 2 min；扩增阶段: 95℃× 3 min，94 ℃× 15 s，55℃ ×15 s，72℃ 30 s( 35 cycles)；最后72℃ 延伸3 min。②PCR产物纯化：PCR扩增后取3 μl产物用0.2 μl ExoI(Fermentas公司)和0.8 μl FastAP(Fermentas公司)纯化。③延伸反应体系：PCR产物2 μl；Snapshot Multiplex kit 1 μl；延伸引物1 μl；双蒸水补至6 μl。延伸反应程序：96℃×1 min；96℃×10 s，52℃×5 s(30 cycles)；60℃×30 s。④测序：延伸产物取1 μl加入10 μlbuffer，95℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪(ABI3730xl)。

1.2.7 基因分型 单核苷酸多态性( single nuleotide polymorphism，SNP) 分型采用GeneMapper 4.1软件进行分析(上海捷瑞生物工程有限公司协助完成)。

2 结果

2.1 IL-17A基因rs2275913位点基因分型 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验分析，P>0.05，表明所选的样本符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。rs2275913位点存在AA、AG、GG三种基因型，基因型峰型见图1。

注：A为AA基因型峰型；B为AG基因型峰型；C为GG基因型峰型

2.2 IL-17A基因rs2275913位点多态性与哮喘易感性关联分析 采用Logistic回归分析比较IL-17A基因rs2275913位点多态性在对照组和哮喘组间差异，结果发现IL-17A基因rs2275913位点基因型和等位基因在哮喘组和健康组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；纳入年龄和性别调整后差异仍具有统计学意义。见表2。

表2 rs2275913基因型及等位基因频率在哮喘组和健康组间比较

注：①*为纳入年龄和性别为调整因素；②表内计数资料数据用[n(%)]表示

2.3 两组间血清IL-17A、IgE水平比较 哮喘组血清IL-17A、IgE表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表3。

表3 血清IL-17A、IgE水平在哮喘组和健康组组间比较

2.4 血清IL-17A、IgE水平与广西黑衣壮哮喘儿童的相关性分析 经Spearman相关性分析结果显示IL-17A、IgE与广西黑衣壮儿童哮喘呈正相关，r值与P分别为：r=0.496，P<0.001；r=0.866，P<0.001。

3 讨论

支气管哮喘是一种慢性异质性疾病，各年龄阶段均可发病，患病率呈逐年增长趋势[5]，据统计全球有3亿多哮喘患者[6]。哮喘受环境、遗传等多方面影响，发病机制复杂，至今尚不完全清楚。人类基因组扫描发现染色体6P基因组区域与哮喘密切相关，IL-17A基因位于6p12.1上，该染色体区域也曾多次报道与哮喘相关[3，7]，因此IL-17A也被认为是哮喘遗传易感性候选基因之一。本研究发现IL-17A基因rs2275913位点与广西黑衣壮儿童哮喘密切相关，AG基因型和G等位基因可能具有降低哮喘发病的风险；血清IL-17A、IgE表达水平在哮喘组和对照组间比较差异具有统计学意义，且血清IL-17A、IgE表达水平与哮喘呈正相关。

rs2275913位点位于IL-17A基因启动子位置，碱基的改变可以影响正常的转录和翻译过程，可能使体内IL-17A表达水平发生变化，进而引起个体对疾病的易感性差异。研究发现IL-17A基因rs2275913多态性可能与强直性脊柱炎[8]、系统性红斑狼疮[9]、胃癌[10]等相关。郭建等[10]通过Meta分析发现rs2275913位点多态性与胃癌发生相关，且携带A等位基因者患胃癌的风险更高，与殷珍珍等[7]人的研究结果一致。与此同时，IL-17A基因rs2275913位点多态性与支气管哮喘的关系也有报道，但结果并不全相同，如：孙先琳等[11]研究发现rs2275913位点多态性与儿童支气管哮喘发病密切相关，携带AA基因型者发生哮喘的风险明显高于携带GG基因型者，且AA基因型可能与哮喘的严重程度及肺功能异常相关。此外，李欣艳等[3]研究也发现IL-17A-152G/A(rs2275913)多态性可能与贵州地区儿童哮喘发病相关且AA基因型可能增加哮喘发病风险。然而，Wang等[12]研究发现IL-17A基因rs2275913位点多态性可能与台湾地区汉族儿童哮喘发病无关。本研究发现IL-17A基因rs2275913位点检测出AA、AG、GG三种基因型，两组间基因型和等位基因分布比较差异均具有统计学意义，logistic回归分析纳入年龄和性别调整后，差异仍具有统计学意义，表明IL-17A基因rs2275913位点多态性可能与广西黑衣壮儿童哮喘的遗传易感性相关，G等位基因可能是广西黑衣壮儿童哮喘发生的保护因素，与李欣艳等[3]、孙先琳等[11]研究结果一致。但本次研究样本量较小，可以扩大样本量进一步研究，并在不同民族及人种间比较，寻找哮喘相关特异性基因，为哮喘的基因治疗奠定基础。

IL-17A是IL-17家族中最早发现的细胞因子，研究也较多，Honda等[13]表明IL-17A能刺激肿瘤坏死因子β(TNF-β)诱导气道上皮细胞生成IL-8，中性粒细胞产生趋化和活化，从而促进气道炎症反应。魏秀娟等[1]发现支气管哮喘急性发作期患儿外周血Th17细胞百分比、IL-17表达水平明显高于缓解期患儿。Hasegawa等[2]研究发现哮喘患者血液中IL-17A表达水平较对照组明显升高，且在难治性哮喘患者血液中IL-17A表达水平则更高，与Dimitrova等[14]研究的结果一致。本研究发现，在广西黑衣壮哮喘儿童中，血清IL-17A表达水平较健康对照组明显升高，差异具有统计学意义，进一步采用Spearman相关性分析血清IL-17A水平与广西黑衣壮哮喘儿童关系性，结果发现IL-17A血清表达水平与哮喘呈正相关，说明血清中高水平的IL-17A可能是广西黑衣壮儿童发生哮喘的危险因素。

IgE高表达是哮喘的特征之一，其介导Ⅰ型变态反应，当机体再次接触过敏原时，IgE效应细胞发生脱颗粒，释放多种炎症介质，导致哮喘的气道高反应、气道重塑等发生。徐影等[15]研究发现外周血IgE水平可能是评估儿童哮喘病情严重程度的重要指标。Rath等[16]研究也发现与IgE正常或降低的哮喘组比较，高IgE哮喘组急性发作及使用糖皮质激素次数更多，检测肺功能FEV1%数值、哮喘控制实验评分更低。本研究发现，黑衣壮哮喘儿童外周血IgE水平明显高于健康对照组，差异具有统计学意义，采用Spearman相关分析发现血清IgE水平与广西黑衣壮儿童哮喘密切相关。

综上所述，IL-17A基因rs2275913位点多态性及血清IL-17A、IgE表达水平可能与广西黑衣壮儿童哮喘发病存在相关性。