锦绣杜鹃花瓣色素及总酚含量分析

钱大伟, 陈小梅, 李 敏, 邱栋梁

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

锦绣杜鹃(RhododendronpulchrumSweet)属杜鹃花科杜鹃花属植物, 在我国江苏、浙江、福建、江西等地广泛分布, 常用于园林和庭院绿化[1]。杜鹃花属植物除了极高的园林观赏价值外，还在食品、医药、保健等领域具有广阔的开发前景[2]。目前，有关锦绣杜鹃的研究报道主要集中在生产应用与类黄酮分析[2-5]，对其花青素的研究较少。花青素在植物体内分布广泛，主要积累在花瓣表皮细胞的液泡里，是构成植物花瓣颜色的主要水溶性色素之一[6-7]。花青素还具有多种生物活性，可调节血脂、预防高血压、保护血管、抗炎、抗糖尿病及抗肿瘤等[8]。杜鹃花属植物富含天然花青素，是提取天然食用色素的优良植物来源[9]。锦绣杜鹃花色与花瓣色素组成、花瓣表皮组织结构及理化性质、液泡内pH值以及花瓣的细胞结构等多种因素相关,而花瓣色素组成是其最重要的影响因素[10]。花期也是影响花瓣颜色的重要原因，随着花瓣的衰败，花瓣吸收营养物质的能力减弱，花青素合成减少而分解加速，花色减退，颜色变浅[11-12]。本试验旨在探究3种不同花色锦绣杜鹃在不同花期花青素、总酚和类黄酮含量及其变化，为选育杜鹃花新品种和提取锦绣杜鹃花青素和类黄酮提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试锦绣杜鹃紫花品种‘紫蝴蝶’、粉花品种‘粉鹤’、白花品种‘玉蝴蝶’， 均采自福建农林大学校园。从植株的东西南北各个方向随机采取生长健康的花蕾期、盛花期、末花期花朵各20朵，3个品种共计180朵。采样标准如下：花蕾期的花苞闭合，处于显色状态；盛花期的花朵开放，花梗挺立；末花期的花梗开始向下弯曲，花瓣边缘出现皱褶。不同品种锦绣杜鹃各花期见图1。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 紫外分光光度计UV-Vis，为北京普析通用仪器有限公司生产；LC-100高效液相色谱仪，为上海伍丰科学仪器有限公司生产；色谱柱为Brisa LC2 C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；3K15高速冷冻离心机，为德国Sigma公司生产。

1.2.2 试剂 芦丁、没食子酸、福林酚，市售。飞燕草素葡萄糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、天竺葵素葡萄糖苷、芍药素葡萄糖苷和锦葵素葡萄糖苷等标准品均购于北京索莱宝科技有限公司。甲醇、乙腈购于上海麦克林生化科技有限公司，甲酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 样品提取液制备

参照罗向东等[13]方法。将新鲜的锦绣杜鹃花瓣剪碎，准确称取0.5 g花瓣置于试管中，加入10 mL 1%(体积比)盐酸甲醇提取液，在黑暗处浸提24 h，过滤后即得样品提取液。每个处理3次重复。

1.4 总酚含量测定

1.4.1 标准曲线绘制 参考许海棠等[14]的测定方法，配制系列质量浓度( 20、40、60、80、100 μg·mL-1)没食子酸标准溶液。精密量取0.1 mL没食子酸标准溶液置于试管中，加入0.5 mL福林酚试剂和4 mL水，反应5 min后，加入7%(质量比)Na2CO3溶液1 mL，室温下避光放置2 h后，在765 nm波长处测定光密度。以质量浓度(X)对光密度(Y)进行回归，没食子酸为标准品进行标准曲线绘制。没食子酸在0.02～0.10 mg·mL-1内线性良好, 回归方程为：Y=1.567X+0.106 4，R2=0.998。

1.4.2 测定方法 分别取0.1 mL样品溶液置于试管中，按1.4.1的方法处理后测定光密度，代入标准曲线，计算总酚含量。以每克花瓣中含有没食子酸的毫克数来表示总酚含量[14]。对各植物提取液进行测定，并按标准曲线方程计算总酚含量。

1.5 类黄酮含量测定

1.5.1 标准曲线绘制 参考韩红娟[15]有关类黄酮含量测定方法，配制系列质量浓度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)芦丁标准溶液。吸取0.2 mL芦丁标准溶液置于试管中，加入2 mL蒸馏水及0.15 mL 5%(质量比)NaNO3溶液，混匀；静置6 min后加入0.15 mL 10%(质量比)Al(NO3)3溶液，混匀；静置 6 min后加入2 mL 4%(质量比)NaOH溶液，混匀；避光静置15 min后，在510 nm处测光密度。以质量浓度(X)对光密度(Y)进行回归，芦丁为标准品进行标准曲线绘制。芦丁在0.1～0.5 mg·mL-1内线性良好,回归方程为：Y=1.813X-0.007 5，R2=0.955。

1.5.2 测定方法 分别取0.2 mL样品溶液置于试管中，按1.5.1的方法处理后测定光密度，计算类黄酮含量。以每克花瓣中含有芦丁的毫克数来表示类黄酮含量[14]。对各植物提取液进行测定，并按标准曲线方程计算类黄酮含量。

1.6 花青素各组分含量测定

1.6.1 标准曲线绘制 将制备的花色苷标准溶液用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定分析后进行标准曲线绘制，其中X轴坐标是液相图谱标识峰面积，Y轴坐标是标准溶液的浓度。

1.6.2 测定方法 将提取液经过0.22 μm滤膜过滤，取30 μL样品液进行HPLC分析。HPLC仪器为DGU-20-A3/LC-20AD；分析条件：检测波长为520 nm，采用Cosmosil 5C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.)，流动相A为水∶乙腈∶甲酸=40∶50∶10(体积比)，流动相B为水∶乙腈∶甲酸=87∶3∶10(体积比)，柱温45 ℃，流速1 mL·min-1，梯度洗脱条件为：①0～15 min：6%A→30%A；②15～30 min：30%A→50%A；③30～35 min：50%A→60%A；④35～40 min：60%A→6%A。

1.7 统计与分析

应用LC-WS100色谱工作站软件进行HPLC图谱绘制；采用Excel 2010进行数据整理和作图；利用SPSS 22软件的LSD法进行多重比较方差分析。

2 结果与分析

2.1 锦绣杜鹃花瓣总酚及类黄酮含量比较

从表1可知，‘玉蝴蝶’在花蕾期、盛花期与末花期的总酚含量均高于‘粉鹤’和‘紫蝴蝶’，‘紫蝴蝶’的总酚含量最低。在花蕾期，‘玉蝴蝶’总酚含量高达9.905 mg·g-1，而‘紫蝴蝶’总酚含量仅6.414 mg·g-1。随着花瓣衰老，3种杜鹃花瓣中总酚含量均呈下降趋势，‘紫蝴蝶’、‘粉鹤’、‘玉蝴蝶’在末花期的总酚含量分别是花蕾期的68.2%、68.8%、67.5%。类黄酮含量与总酚变化趋势基本一致，在花蕾期，‘玉蝴蝶’类黄酮含量为3.115 mg·g-1，而‘紫蝴蝶’类黄酮含量为1.732 mg·g-1。‘紫蝴蝶’、‘粉鹤’、‘玉蝴蝶’在末花期的类黄酮含量分别是花蕾期类黄酮含量的70.0%、67.9%、72.5%。‘玉蝴蝶’、‘粉鹤’花瓣中的总酚和类黄酮含量在各花期均显著高于‘紫蝴蝶’。

表1 3个品种锦绣杜鹃花瓣的总酚及类黄酮含量1)Table 1 Contents of total phenols and flavonoids in the petals of 3 Rhododendron cultivars mg·g-1

1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

2.2 锦绣杜鹃花瓣花青素组分及含量比较

对3个品种锦绣杜鹃不同花期花青素含量进行比较分析，结果见图2。从图2可知，3个不同花期‘紫蝴蝶’花青素含量均高于‘粉鹤’与‘玉蝴蝶’，‘玉蝴蝶’花青素含量极低。3个品种锦绣杜鹃的花青素含量均在花蕾期最高，随着花瓣的衰老而逐渐降低。采用HPLC对锦绣杜鹃花瓣色素成分及含量进行分析，并与标准品进行比较(图3)。从图3可见，‘紫蝴蝶’和‘粉鹤’均在7.60、8.90、10.20、11.50、15.40 min左右开始出现单一高峰，这与标准品飞燕草素(7.03 min)、矢车菊素(8.95 min)、天竺葵素(10.68 min)、芍药色素(11.61 min)、锦葵色素(15.06 min)检测到的时间相符合，而‘玉蝴蝶’中未检测到上述吸收峰，推测锦绣杜鹃花青素含量变化与不同品种花朵颜色深浅变化相关性较大。

锦绣杜鹃花瓣不同花期花青素各组分含量见表2。从表2可知，芍药色素是‘紫蝴蝶’的主要花青素。在花蕾期、盛花期、末花期，芍药色素分别占总花青素含量的66.6%、63.8%、61.1%，由此判断，芍药色素是使‘紫蝴蝶’呈现紫红色色泽的主要花青素。天竺葵色素是‘粉鹤’的主要花青素。在花蕾期、盛花期、末花期，天竺葵色素分别占总花青素含量的43.6%、47.9%、56.2%，由此判断，天竺葵色素是‘粉鹤’呈现粉红色花瓣的主要花青素。花青素各组分在‘玉蝴蝶’中均未检出。从表2也可看出，随着花瓣衰老，锦绣杜鹃花瓣花青素各组分含量都呈现下降趋势，猜测在锦绣杜鹃花苞形成早期，花瓣内已完成花青素的合成，随着花朵开放，花瓣内花青素被逐渐分解，这可能与花瓣内水解酶活性升高有关，其原理仍需进一步研究。

表2 3个品种锦绣杜鹃花瓣花青素各组分含量1)Table 2 The content of anthocyanin components in the petals of 3 Rhododendron cultivars mg·kg-1

1)ND表示花瓣中未检测到该色素。

3 讨论与结论

植物中天然色素分为叶绿素、类黄酮、甜菜色素和类胡萝卜素4大类[16]。类黄酮是植物花色形成的物质基础之一，花色为白色的植物，花青素含量极低，主要以黄酮为主[17]。在锦绣杜鹃中，类黄酮含量以白色系花瓣为高，粉红色系和紫色系花瓣则显著低于白色花瓣。‘玉蝴蝶’中总酚和类黄酮的含量显著高于花青素，究其原因可能与品种有关，这一结果与花椒颜色深浅和黄酮含量呈正相关[18]相一致。

类黄酮和总酚属于多酚类物质。本试验结果显示，锦绣杜鹃花瓣中总酚含量特征与类黄酮相似，此结果与张永福等[19]对凤仙花总酚和类黄酮含量分析结果相一致。杜鹃花瓣中的黄酮醇主要有槲皮素、山奈酚、杨梅素等[20-21]，有利于辅助色素的形成。本研究中不同锦绣杜鹃品种花青素含量与类黄酮、总酚含量存在差异，由此推测，杜鹃花花色变化是由花瓣色素的组分和含量的变化造成的。

本试验利用HPLC技术对锦绣杜鹃花瓣进行定性定量分析，共检测到5种花青素成分，分别是飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药色素和锦葵色素。花青素含量是影响花色亮暗和色调的重要因素，随着花青素含量的增加，花瓣颜色变暗，逐渐转为紫红色和紫色[22]。而总酚和类黄酮对花青素有辅助效应，总酚和类黄酮浓度较高的植物花瓣通常呈现出饱满的色彩[23]。本研究表明，锦绣杜鹃‘紫蝴蝶’、‘粉鹤’花瓣因含有总酚、类黄酮和花青素而分别呈现紫红色和粉红色，‘玉蝴蝶’花瓣含有总酚和类黄酮，缺少花青素呈现白色，说明锦绣杜鹃花瓣颜色变化是以花青素为主，总酚和类黄酮为辅的复合型花色素表现而形成[23]，这与李崇晖等[24]研究‘迎红’杜鹃淡紫红色是由类黄酮与色素总量共同形成的研究结果相一致。从3种不同颜色锦绣杜鹃的色素定量分析可以看出，花青素的含量逐渐增多时，锦绣杜鹃花瓣颜色加深，‘紫蝴蝶’花青素含量最高，‘玉蝴蝶’含量最低，说明锦绣杜鹃深色系形成的主要原因是含有大量花青素，这与李敏等[25]对鸳鸯茉莉和王志广等[26]对铃儿花花青素含量的定量分析结果相一致。

花青素对杜鹃花属植物花色的测定具有重要意义。一般来说，花青素以糖苷的形式存在，糖苷由糖基连接而成，由于花青素糖苷元或糖基组成的不同，导致花的颜色不同。天竺葵色素、矢车菊素和芍药色素有利于红花的形成；飞燕草色素和锦葵色素有利于蓝花的形成[16]。由此推测，芍药色素是‘紫蝴蝶’花瓣呈现紫红色的主要原因，天竺葵色素是‘粉鹤’花瓣呈现粉红色的主要原因。同时，3种锦绣杜鹃花瓣不同花期花青素组分和含量存在差异，或许与不同发育期品种间以及品种内相关代谢酶活性和代谢途径都存在差异有关，仍需进一步研究。