5个蝙蝠蛾拟青霉菌株的对比筛选

王锦锋, 陆海峰, 王 忠, 吴鸿雪

(安发福建生物科技有限公司/福建省天然生物活性物质企业重点实验室，福建 宁德 352000)

蝙蝠蛾拟青霉(PaecilomyceshepialiQ.T. Chen et al)是从冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk)]子座中分离获得、经国家批准可食用的真菌菌种[1-2]。蝙蝠蛾拟青霉的主要活性成分为腺苷和甘露醇，具有抗肿瘤[3]、抗疲劳[4]、增强免疫力[5]和抑菌[6]等功效。据报道，蝙蝠蛾拟青霉和天然冬虫夏草的主要药理成分基本相似[7-8]，通过深层发酵培养获得的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体可作为野生冬虫夏草的替代品，已开发成相关药品和保健品[9-10]。目前，关于蝙蝠蛾拟青霉的报道很多，主要涉及有效成分分析和发酵工艺优化，而菌株之间的比较筛选则较少[11-13]。本研究以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体菌丝干重与腺苷、甘露醇、粗多糖、蛋白质、灰分含量作为指标筛选优质菌株，以期为其规模化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 5个供试菌株分别编号为T1～T5。其中，菌株3.1487(T1)和3.1772(T2)购自中科院微生物研究所，菌株5494(T3)购自北京华工科创生物有限公司，菌株B01461(T4)购自明舟生物科技有限公司，菌株BN339916(T5)购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.1.2 供试培养基 (1)斜面培养基：200 g去皮马铃薯+20 g葡萄糖+18 g琼脂，定容至1 000 mL，pH自然。(2)液体种子培养基：20 g葡萄糖+5 g蛋白胨+0.5 g MgSO4·7H2O+1.0 g KH2PO4+0.1 g VB1。超纯水定容至1 000 mL，用5 mol·L-1NaOH溶液将pH值调至6.5。(3)液体发酵培养基：40 g葡萄糖+15 g酵母浸粉+15 g蛋白胨+2 g MgSO4·7H2O+2.0 g KH2PO4+0.1 g VB1。超纯水定容至1 000 mL，用5 mol·L-1NaOH溶液将pH值调至6.5。

1.1.3 试剂与仪器 (1)试剂：葡萄糖、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、VB1，均为分析纯。(2)仪器：SPX-250BSH生化培养箱，购于新苗有限公司；BSD-YX-2400摇床培养箱，购于上海精宏科学仪器有限公司；电子天平，购于上海精密科学仪器有限公司；XW-80A微型漩涡仪，购于上海沪西分析仪器厂有限公司；其他仪器为常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 将低温保存的5株蝙蝠蛾拟青霉菌株活化后，分别转接至装有斜面培养基的试管中，置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。

1.2.2 菌丝体培养 (1)将配制好的液体种子培养基装瓶，使用接种针将试管母种菌丝切成5 mm×5 mm的菌块，每瓶接种3小块菌种，然后置于25 ℃、120 r·min-1摇床培养箱中培养72 h，备用。(2)使用移液枪吸取蝙蝠蛾拟青霉液体菌种，接种至装有供试培养基的摇瓶中。每瓶按接种量10%进行接种，然后置于25 ℃、120 r·min-1摇床培养箱中培养144 h。取出菌液在4 000 r·min-1下离心10 min。取沉淀物进行真空冷冻干燥，备用。3次重复。

1.2.3 菌丝体粉收率 将培养好的液体发酵菌丝4 000 r·min-1离心10 min，沉淀冻干，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体冻干粉末，称量计算每升发酵液菌粉质量，即为菌丝体粉收率。

1.2.4 腺苷检测方法 (1)色谱条件：Agilent prep-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温 30 ℃；紫外检测器，波长254 nm；流动相10%甲醇—水溶液；流速1 mL·min-1，进样量2 μL。(2)试样制备：以纯水作为提取剂。准确称取0.5 g干燥菌丝体粉末，倒入50 mL容量瓶中，加入约40 mL纯水，超声30 min(300 W，40 kHz)，至室温后定容，充分摇匀，4 000 r·min-1离心5 min。取适量上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后供液相色谱检测用。通过标准曲线，计算腺苷含量[14]。

1.2.5 甘露醇检测方法 准确称取干燥菌丝体粉末0.25 g，置于50 mL容量瓶中，加适量0.01 mol·L-1磷酸钠溶液，充分振摇后，超声提取20 min，放至室温，用0.01 mol·L-1磷酸钠溶液稀释定容后摇匀、过滤，作为供试品溶液。精密吸取10 mL供试品溶液置碘瓶中，加入50 mL高碘酸钠溶液，水浴加热15 min，放至室温，加10 mL碘化钾溶液，密塞放置5 min，用0.05 mol·L-1硫代硫酸钠溶液滴定。至近终点时，加1 mL淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每毫升硫代硫酸钠滴定液(0.05 mol·L-1)相当于0.910 9 mg的甘露醇[15]。

式中，C/0.05为硫代硫酸钠标定浓度与标准浓度的比值；V0为硫代硫酸钠滴定后体积/mL；V1为硫代硫酸钠滴定前体积/mL；W为干燥菌丝粉末质量/g。

1.2.6 粗多糖、蛋白质和灰分的检测 蝙蝠蛾拟青霉粗多糖、蛋白质和灰分含量的检测分别参考文献[16-18]。

1.2.7 灰色关联度分析 灰色关联度分析法[19]对目标性状进行综合描述和量化评估，可有效克服仅考虑单个因素而忽略其他因素的弊端，从而得到更为科学、客观的试验结果。由于各性状的量纲不同，根据灰色系统理论，对各性状先进行无量化处理，再利用MATLAB软件根据公式(1)、(2)编辑程序计算关联系数(εi)和关联度(ri)。

(1)

式中，min min|x0(k)-xi(k)|,max max|x0(k)-xi(k)|分别为二级最小差和二级最大差；ρ为分辨系数，本研究取ρ=0.5。

(2)

式中，N为评价指标个数。本试验设计各指标权重系数相等。

1.3 数据处理

使用SPSS 20.0、Excel及MATLAB软件进行数据处理及图表制作。

2 结果与分析

2.1 蝙蝠蛾拟青霉菌株菌丝干重的比较

液体培养72 h后收集5个菌株菌丝进行冻干，磨成粉末后称重。各菌株菌丝干重见图1。由图1可看出，T2菌株菌丝干重最低，显著低于其他4个菌株(P<0.05)；T1菌株菌丝干重最高，达22.88 g·L-1，但与T3、T4及T5之间无显著差异。总体上，5个菌株菌丝干重从高到低依次为:T1>T5>T3>T4>T2，但各菌株之间差异并不大。

2.2 蝙蝠蛾拟青霉菌株腺苷含量的比较

参考《中华人民共和国药典》[20]，蝙蝠蛾拟青霉腺苷标准含量为1.80 mg·g-1。各菌株菌丝腺苷含量见图2。由图2可看出，5个菌株腺苷含量均高于药典标准。其中，T5菌株含量最高，达2.62 mg·g-1，是标准含量的1.45倍，并显著高于其他4个菌株(P<0.05)；T2菌株含量最低，但也高于标准。总体上，5个菌株腺苷含量从高到低依次为:T5>T3>T4>T1>T2。

2.3 蝙蝠蛾拟青霉菌株甘露醇含量的比较

参考《中华人民共和国药典》[20]，蝙蝠蛾拟青霉甘露醇标准含量≥8.0%。各菌株甘露醇含量见图3。由图3可看出，5个菌株甘露醇含量均高于药典标准。其中，T1菌株含量最高，达12.34%，是标准的1.543倍，T2、T3和T5菌株含量分别是标准的1.534、1.529和1.540倍；T4菌株含量最低，为11.75%，是标准的1.469倍；5个菌株之间无显著差异。总体上，5个菌株甘露醇含量从高到低依次为:T1>T5>T2>T3>T4。

图中不同小写字母表示差异达0.05显著水平(P<0.05)。
图2 5个蝙蝠蛾拟青霉菌株腺苷含量的比较
Figure 2 Comparison of adenosine content of fiveP.hepialistrains

图中相同字母表示差异不显著(P<0.05)。
图3 5个蝙蝠蛾拟青霉菌株甘露醇含量的比较
Figure 3 Comparison of mannitol content of fiveP.hepialistrains

表1 5个蝙蝠蛾拟青霉菌株粗多糖、蛋白质和灰分含量的比较1)Table 1 Comparison of crude polysaccharide, protein, and ash contents of five P.hepiali strains

1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

2.4 蝙蝠蛾拟青霉菌株其他成分含量的比较

5个蝙蝠蛾拟青霉菌株的粗多糖、蛋白质和灰分含量见表1。(1)T5菌株粗多糖含量最高，达4.982%，显著高于其他4个菌株(P<0.05)；T2菌株最低(4.120%)，显著低于其他4个菌株(P<0.05)。(2)T5菌株蛋白质含量最高，达34.523%，与T3菌株无显著差异，但显著高于其他3个菌株(P<0.05)；T2菌株最低(28.072%)，显著低于其他菌株(P<0.05)。(3)T2菌株灰分含量最高，为6.182%，T3菌株最低(5.703%)。灰分越大则质量越差。总体上，5个菌株粗多糖含量从高到低依次为:T5>T1>T3>T4>T2；蛋白质含量从高到低依次为：T5>T3>T1>T4>T2；灰分含量从高到低依次为:T2>T4>T1>T5>T3。

2.5 灰色关联度分析结果

表2 5个蝙蝠蛾拟青霉菌株的关联系数及排序(n=6)Table 2 Correlation coefficient and ranking order of five P.hepiali strains (n=6)

灰色关联度分析中，关联度越大，综合性状越优良，反之，综合性状则越差。本研究选取菌丝干重与腺苷、甘露醇、粗多糖、蛋白质、灰分含量共6项指标进行灰色关联度分析，并依据综合表现来筛选优良菌株。最优参考序列中，菌丝干重与腺苷、甘露醇、粗多糖、蛋白质、灰分含量分别为22.88 g·L-1、2.62 mg·g-1、12.34%、4.982%、34.523%、5.703%。综合分析结果见表2。由表2可知，T5菌株的关联系数最大，表明其综合性状最优良。由于5个菌株菌丝干重和甘露醇含量差异都不大，但T5菌株腺苷含量大于其他菌株，而且粗多糖和蛋白质含量均为最优，故T5菌株综合性状优于其他菌株。T2菌株关联系数最小，表明其综合性状最差。综合来看，T5菌株为最优菌株。

3 小结

目前，蝙蝠蛾拟青霉的菌株筛选、培养基筛选和培养(发酵)条件优化，均以腺苷和甘露醇2个主要有效成分含量来判断其优劣[21]。本研究以《中华人民共和国药典》[20]中的蝙蝠蛾拟青霉(金水宝)含量为标准，分析比较了5个菌株菌丝干重与腺苷、甘露醇、粗多糖、蛋白质及灰分的含量。结果表明，5个菌株的表现均高于《中华人民共和国药典》标准，且最主要有效成分腺苷和甘露醇含量比标准超高。5个菌株的腺苷和甘露醇含量均高于标准，可能由于5个菌株均为当地的优势菌株。另外，5个菌株在粗多糖、蛋白质及灰分含量上存在差异。采用灰色关联度分析表明，5个菌株中T5菌株(BN339916)为最优菌株，可作为企业生产的优良菌株。