海生红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)中藻胆体的制备

侯翠英,台丹丹,赵明日,孙 力

(烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005)

藻胆体(Phycobilisome,PBS)是蓝藻、灰胞藻和红藻所特有的捕光色素蛋白复合体,由负责捕获和传递光能的藻胆蛋白(phycobiliprotein,PBP)和连接多肽组成(linker polypeptide,L)[1-2],通过核膜连接多肽(core-membrane linker polypeptide,LCM)锚定在类囊体膜的基质侧[3-4],并与二聚体光系统PSⅡ的两个光反应中心偶连[4]．根据已报道的藻胆体的结构模型,藻胆体由藻红蛋白(phycoerythrin,PE)和藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)及其连接多肽构成的“棒”(rod)亚结构域和由别藻蓝蛋白(allphycocyanin,AP)及核连接多肽构成的“核”(core) 亚结构域两部分组成,其中“核”被外周的“棒”状结构呈发散状围绕着[5-6]．外围“棒”状结构将捕获的光传递给“核”,最后传递给位于类囊体膜内、藻胆体下方的PSⅡ的光反应中心叶绿素a[7]．藻胆体的这种高效、单向光能传递完全取决于其各类藻胆蛋白-连接多肽复合体在藻胆体内的有序组装．

PBS最先是在单细胞红藻紫球藻(Porphyridiumcruentum)中被发现的,但到目前为止有关藻胆体结构与功能的研究报道主要来自蓝藻[8-12],来自红藻尤其是大型红藻藻胆体的研究报道很有限．近期来自紫球藻(Porphyridiumcruentum)半球型藻胆体[13-14]、调毛藻GriffithsiapacificaBlock-type藻胆体[15-17]结构研究,进一步证明红藻的藻胆体远比蓝藻要复杂．PBS中各藻胆蛋白之间、各藻胆蛋白及其连接多肽之间、各藻胆蛋白-连接多肽复合体之间的相互作用和有序组装方式,还需要进一步深入研究确定．

多管藻(Polysiphoniaurceolata),属红藻门(Phodophyta),真红藻纲(Florideae),仙菜目(Ceramiales)[18],是一种大型真核红藻,主要在潮间带的岩石上攀附生长或盐泽地带生长．

研究表明,多管藻中含有的藻胆蛋白有R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)、R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin,R-PC)和别藻蓝蛋白 3类,其中R-PE在498 nm、538 nm和567 nm处有特征吸收峰,携带藻红胆素(phycoerythrobilin,PEB)和藻尿胆素(phycourobilin,PUB),紫外光下发黄色荧光[19-21];R-PC含有藻红胆素(PEB)和藻蓝胆素(phycocyanobilin,PCB),在550 nm和618 nm有特征光吸收,荧光发射峰在635～645 nm之间[22-24];AP携带藻蓝胆素(PCB),在650 nm和620 nm分别有特征吸收峰和肩峰,荧光发射峰值在660～680 nm[25]．别藻蓝蛋白可分为AP,AP-B和AP-核膜连接多肽复合体(AP-LCM) 3类,其中AP含量较多,AP-B和AP-LCM数量相等．当用498 nm R-PE特征吸收光激发时,F670～680/F580～590可作为藻胆体结构完整性的参照指标[26-27],且比值越大,表明光能传递效率越高,结构越完整．

从藻类样品中提取、分离制备出结构形态完整的藻胆体是藻胆体结构与功能研究的重要基础．到目前为止蔗糖密度梯度超速离心一直是高纯度完整藻胆体有效分离制备的常用技术方法,所以本研究以多管藻为材料,在Triton X-100增溶和无Triton X-100增溶条件下利用亚超速蔗糖密度梯度离心进行藻胆体的分离与制备,并进一步用蔗糖密度梯度超速离心分析所得藻胆体样品中的完整藻胆体组分;根据增溶前后的吸收和荧光光谱及F670～680/F580～590,比较表面活性剂增溶前后所得藻胆体的光谱特性差异及其结构完整性,建立可用于有效制备带有类囊体膜和不带有类囊体膜的红藻完整藻胆体的蔗糖密度梯度离心技术方法．

1 材料与方法

1.1 材料

实验选用的多管藻是一种生活在较低温度环境中、烟台当地海域易于采集的海生大型红藻．

1.2 藻胆体的粗提取

取适量采集的多管藻沥干水分,按照1∶1的质量体积比加入1.0 mol/L PBS进行研磨,样品匀浆40 000×g,18 ℃,离心15 min,得到含有藻胆体的上清液．取部分上清液加入20% Trion X-100进行增溶,使得溶液中Trion X-100最终体积分数为2%,磁力搅拌过夜．将Triton X-100增溶和无Triton X-100增溶的藻胆体提取液避光于4 ℃冷藏保存,用于后续实验．

1.3 密度梯度离心

1.3.1 亚超速蔗糖密度梯度离心 对2种藻胆体提取液进行蔗糖密度梯度离心．分别将1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mol/L梯度液自下而上的铺入容积为38 mL的离心管．将提取液注入梯度上层,95 000×g,20 ℃离心3 h,得到携带部分类囊体膜和无类囊体膜(Triton X-100增溶)的2种藻胆体．

1.3.2 超速蔗糖密度梯度离心 对亚超速离心制备的2种藻胆体进一步进行超速蔗糖密度梯度离心．38 mL的超速离心管加盖后同样自下而上的铺入1.2、1.0、0.8、0.75、0.5 mol/L梯度液,最后将两种藻胆体样品分别加入梯度液上层,136 000×g,20 ℃离心5 h．收集不同梯度处的藻胆体样品条带,并进行吸收光谱和荧光光谱分析,确定同一个样品不同梯度带的差别．

1.4 光谱测定

密度梯度离心后收集的样品条带利用紫外可见分光光度计(UV-190型,北京普析)以该梯度处的蔗糖溶液为空白对照,测定样品在250～750 nm的吸收光谱．

将不同阶段收集的藻胆体使用荧光分光光度计(PE LS-55)进行Ex=498 nm、Ex=430 nm荧光发射光谱和Em=680 nm荧光激发光谱的测定．

2 实验结果

用亚超速密度梯度离心从藻胆体提取液中分离制备藻胆体,用密度梯度超速离心分离藻胆体组分．通过吸收和荧光光谱分析,确定离心所得各梯度带组分的藻胆蛋白组分及其藻胆体结构完整性,对不同藻胆体组分的差异性进行综合分析．

2.1 亚超速蔗糖密度梯度离心

2.1.1 不同蔗糖密度梯度带 如图1所示,在95 000×g蔗糖密度梯度离心后,无表面活性剂增溶的藻胆体提取液被分离成3个组分(图1(a)):在梯度液最上层蔗糖浓度为0.1 mol/L处的红色条带(0.1M-Band),在0.2 mol/L蔗糖梯度内的紫色条带(0.2M-Band)和0.8～1.0 mol/L蔗糖梯度底部的褐色条带(0.8M-Band)．此外,在离心管的底部有少许杂质沉淀．收集3个不同梯度条带处的样品并进行吸收光谱和荧光光谱特性分析．

Triton X-100藻胆体提取液(图1(b))离心后只有2个组分:位于最上层蔗糖浓度0.1 mol/L处的红色条带(0.1M-Triton-Band)和位于0.2 mol/L蔗糖梯度内的紫色条带(0.2M-Triton-Band),且分层更明显尤其是0.2 mol/L蔗糖梯度内的紫色条带无弥散现象．这与Triton X-100促进了疏水性成分的有效溶解有关．

2.1.2 0.1 mol/L蔗糖密度梯度带 图2给出的是0.1M-Band和0.1M-Trit-Band红色样品的吸收光谱．2个样品在498 nm、539 nm、567 nm处有较强的R-PE的3个特征吸收峰,且在620 nm 处有明显的R-PC的吸收峰(0.1M-Band)或肩峰(0.1M-Trit-Band),两者在650 nm处的吸收较弱且均没有表现出吸收峰或肩峰,但这并不能排除AP的存在．2个样品光吸收的差别主要表现在:(1)0.1M-Band在686 nm有一个主要来源于PSⅡ叶绿素-蛋白复合体的吸收峰,而0.1M-Trit-Band没有,此外在580～620 nm 0.1M-Trit-Band的光吸收稍强于0.1M-Band;(2)与0.1M-Trit-Band相比,0.1M-Band在539 nm 及480～530 nm有稍强的光吸收;(3)0.1M-Band在360～460 nm的光吸收均强与0.1M-Trit-Band．

如图3的荧光发射光谱所示,当选用498 nm R-PE特征吸收光激发0.1M-Band和0.1M-Triton-Band样品时(图3(a)),在578 nm表现出一个来自R-PE的强荧光发射峰,同时在640 nm有一个较弱的来自R-藻蓝蛋白的荧光发射肩峰,而且0.1M-Triton-Band样品在630～660 nm的荧光均稍强于0.1M-Band．如图3(b)所示,当选用叶绿素a (Chl a)的特征吸收430 nm光激发时,除共有的579 nm主峰外,两者荧光发射谱的差别主要表现在625～725 nm之间,如0.1M-Triton-Band在638 nm和673 nm有略强的与R-藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及Chl a相关的荧光,而0.1M-Band在700～720 nm有相对略强的来自光反应系统(PSⅡ/PSⅠ)Chl a-蛋白复合物的荧光．

综合吸收光谱和荧光光谱特性,0.1M-Band和0.1M-Trit-Band样品中主要含有R-PE和R-PC,0.1M-Trit-Band样品中含有一些游离的Chl a,而没表面活性增溶的0.1M-Band含有少量Chl a-蛋白复合物．此外,荧光发射谱(图3a)中640 nm处的肩峰表明在0.1M-Band和0.1M-Trit-Band中含有R-PE和R-PC的复合物(R-PE-R-PC复合物),因为用498 nm 激发R-PE时有光能传递给R-PC,发出约640 nm的R-PC特征荧光．0.1M-Trit-Band样品640 nm处荧光更强表明应含有较多R-PE-R-PC复合体．

2.1.3 0.2 mol/L蔗糖密度梯度带 如图4吸收光谱所示,0.2 mol/L蔗糖梯度带无表面活性剂增溶(0.2M-Band)和Triton X-100增溶(0.2M-Triton-Band)2种紫色样品,在450～600 nm均有较强的R-PE特征光吸收,但0.2M-Triton-Band在499 nm和540 nm处的吸收略大于0.2M-Band及解离藻胆体样品．同样,3个样品在600～660 nm 之间均表现出R-PC 620 nm和别藻蓝蛋白～650 nm的吸收,而且0.2M-Triton-Band的吸收稍强于0.2M-Band和解离藻胆体,此外0.2M-Band和0.2M-Triton-Band有相似的吸收光谱线形而且均强于解离藻胆体.与0.2M-Triton-Band不同,0.2M-Band在686 nm 有一个明显且相对较强的吸收峰,这一吸收应主要源于PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物,因为无表面活性剂增溶制备的样品会含有部分与藻胆体相连的PSⅡ/PSⅠChl a-蛋白复合物．相比之下,显然用Triton X-100增溶制备的0.2M-Triton-Band样品中基本不含Chl a-蛋白复合物．

图5是0.2M-Band、0.2M-Triton-Band和解离藻胆体的荧光发射光谱．在498 nm激发时(图5(a)),0.2M-Band和0.2M-Triton-Band分别在674 nm和670 nm有强荧光发射峰,在589 nm和579 nm有弱荧光发射峰,且F674/F589和F670/F579大于3．与此相反,解离藻胆体主峰在578 nm,此外仅在约640 nm有弱的肩峰．这一结果表明,亚超速蔗糖密度梯度离心制备的0.2M-Band和0.2M-Triton-Band样品是完整藻胆体,674 nm和670 nm的荧光发射峰来自于藻胆体中的末端荧光发射体AP-LCM和AP-B,而589 nm和579 nm的弱峰来自于R-PE,表明激发R-PE的498 nm光可以高效传递到藻胆体的末端荧光发射体AP-LCM和AP-B,但在解离藻胆体中(图5(a)中的点线)没有这种光能传递．

如图5(b)所示,430 nm Chl a特征吸收激发时3个样品的荧光发射光谱与图5(a)相似,也表现出完整藻胆体的荧光发射光谱特征,但与0.2M-Triton-Band相比0.2M-Band在700～ 800 nm有相对较强的荧光发射,而且在约720 nm表现出可分辨的肩峰,表明0.2M-Band样品含有来自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物．

0.2M-Band和0.2M-Triton-Band的光谱特性表明:(1)两者具有非常相似的藻胆蛋白组成(图4);(2)686 nm的吸收峰 (图4)和700～800 nm的荧光(图5(b))证明,两者的主要不同在于0.2M-Band的藻胆体带有部分类囊体膜PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物,而Triton X-100 增溶处理的0.2M-Triton-Band藻胆体已不带有PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物;(3)大于3的F674/F589和F670/F579(图5(a)) 或F674/F591和F674/F582(图5(b))荧光比值证明,两者在所含各藻胆蛋白组分之间有非常高效的光能传递,因此两者均为95 000×g亚超速蔗糖密度梯度离心制备的完整藻胆体,但0.2M-Band的藻胆体带有与其相结合的类囊体膜PSⅡ/PSⅠ组分而0.2M-Triton-Band不带．

2.1.4 0.8～1.0 mol/L蔗糖密度梯度带 位于0.8～1.0mol/L 蔗糖梯度带的黄褐色样品(0.8M-Band)仅出现在无表面活性剂增溶处理的藻胆体提取液中(图1)．0.8M-Band的吸收光谱表现出较强的R-PE(470～600 nm)和R-PC与AP(610～650 nm)的特征光吸收(图6虚线),680 nm的弱吸收峰主要来自PSⅡ/PSⅡ的Chl a-蛋白复合物,此外在250～450 nm有很强的光吸收．荧光激发光谱 (图6实线)显示,680 nm的荧光主要来自R-PE(500～565 nm)、R-PC和AP(615～650 nm),而位于约413 nm的激发峰证明Chl a对680 nm的荧光有贡献．吸收光谱中498 nm处的特征吸收峰值最大但是对680 nm处的荧光贡献较小,说明该条带中藻红蛋白498 nm的发色团吸收的光能传递给末发射体的效率较低．

图7是0.8M-Band样品在498 nm和430 nm光激发时的荧光发射光谱．498 nm激发时有2个荧光发射峰(图7实线),580 nm的荧光来自R-PE而670 nm的荧光主要来自PBS中的末端发射体AP-LCM和AP-B．这一结果表明,在0.8M-Band中有R-PE经R-PC和AP向AP-LCM与AP-B的光能传递,但因F670/F580小于1其光能传递效率不高,因此该样品中含有结构不完整的部分解离藻胆体组分．用430 nm Chl a蓝光区特征吸收光激发时,0.8M-Band样品的荧光发射主峰位于682 nm且在约714 nm有可分辨的肩峰,两者应主要来自PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白复合物;位于578 nm的弱荧光发射峰应来自于所含有的藻胆体R-PE．

根据光谱特性(图6和图7),0.8M-Band样品含有藻胆体藻胆蛋白和类囊体膜PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白复合物．因F670/F580小于1(图7实线),0.8M-Band样品所含藻胆体内的光能传递效率不高,其有部分解离或结构不完整．498 nm (图7实线)和430 nm (图7虚线)光激发时的荧光发射光谱在670～700 nm之间有较大重叠,这证明0.8M-Band样品中的藻胆体(或藻胆蛋白)与PSⅡ和PSⅠ的Chl a-蛋白复合物有一定程度的光能传递,表明两者之间有结合或有着密切的结构联系．

2.2 超速蔗糖密度梯度离心

2.2.1 藻胆体的不同梯度带组分 亚超速密度梯度离心制备出的位于0.2 mol/L蔗糖密度带(0.2M-Band和0.2M-Triton-Band)的2种完整藻胆体样品(图1),一种是无Triton X-100增溶制备的携带(或含有)部分类囊体膜的藻胆体(the phycobilisome carrying (or containing) thylakoid membranes,TM-PBSs) (图1(a) 0.2M-Band),另一种是经Triton X-100增溶后制备的不带(或不含)类囊体膜的藻胆体(the phycobilisome carrying (or containing) no thylakoid membrane,NTM-PBS) (图1(b) 0.2M-Triton-Band)．

如图8所示,在超速离心后2种PBS样品TM-PBSs (图8(a))和NTM-PBSs (图8(b))被分离成位于相同蔗糖梯度液层(sucrose gradient layer,L)的4个紫红色PBS组分,分别是0.8 mol/L PBS (PBS in 0.8 mol/L layer,PBS 0.8L)、1.0 mol/L PBS (PBS in 1.0 mol/L layer,PBS 1.0L)、1.2 mol/L PBS (PBS in 1.2 mol/L layer,PBS 1.2L)和1.2 mol/L管底PBS (PBS in 1.2 mol/L layer on the bottom,PBS 1.2B)．

在相同条件下,对收集到的1.0 mol/L梯度藻胆体 (TM-PBS 1.0L与NTM-PBS 1.0L)和1.2 mol/L管底藻胆体 (TM-PBS 1.2B与NTM-PBS 1.2B)再做一次超速离心,结果如图9所示,这2类样品均分离成2种组分,分别位于0.8 mol/L和1.2 mol/L 梯度层．这一结果表明,位于1.0 mol/L梯度和1.2 mol/L 管底的藻胆体,即TM-PBS 1.0 L与NTM-PBS 1.0 L和TM-PBS 1.2B与NTM-PBS 1.2B是2种不能稳定存在的藻胆体,而位于0.8 mol/L的藻胆体(TM-PBS 0.8L与NTM-PBS 0.8L)和1.2 mol/L的藻胆体(TM-PBS 1.2L与NTM-PBS 1.2L)则是密度或大小不同且结构稳定的2种藻胆体．

2.2.2 不同梯度带藻胆体组分的光谱特性 图10是带类囊体膜藻胆体TM-PBSs中,4个超速离心组分的吸收光谱．从吸收光谱可以看出,除了R-PE、R-PC和AP的特征吸收外,4个组分都有685 nm Chl a-蛋白复合物的特征光吸收,A685从大到小依次为TM-PBS 1.0L、TM-PBS 1.2L、TM-PBS 1.2B和TM-PBS 0.8L,此外主要与Chl相关的～379 nm光吸收也有相同的大小顺序．在498 nm TM-PBS 0.8L的峰值最低,表明其含有相对最低的R-PE,但其在620 nm和650 nm的较低光吸收应主要与含有相对较低的Chl a-蛋白复合物有关．

与带类囊体膜藻胆体TM-PBSs相比,不带类囊体膜的藻胆体NTM-PBSs (图11) 的4个组分均没有685 nm Chl a-蛋白复合物的光吸收,但在300～400 nm处的光吸收差别较大且应与Chl a无关．498 nm的光吸收差别表明,NTM-PBS 1.0 L有相对最高的R-PE含量,其次是NTM-PBS 1.2L和 NTM-PBS 1.2B,最低的是NTM-PBS 0.8L,620 nm和650 nm的光吸收有相似的特征．

如图12和13所示,在498 nm R-PE特征吸收激发时,TM-PBS和NTM-PBS的4个藻胆体组分具有非常相似的荧光发射光谱:在670 nm有一个来自藻胆体末端发射体(AP-LCM和AP-B)的强荧光峰 (F670),在578 nm有一个来自R-PE的较弱的荧光峰(F578),而且F578的强弱与各组分在498 nm的光吸收(A498)的大小相一致(图10、11)．F670强F578弱证明,在这4个组分的藻胆体中R-藻红蛋白所吸收的光能可有效传递到末端发射体AP-LCM和AP-B,F670/F578比值最大的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L藻胆体组分光能传递效率最高,F670/F578比值最小的TM-PBS 1.0L和NTM-PBS 1.0L组分光能传递效率相对最低,而TM-PBS 1.2L与NTM-PBS 1.2L和TM-PBS 1.2B与NTM-PBS 1.2B藻胆体的光能传递效率介于上两者之间．

选用430 nm Chl a特征吸收作激发光时,TM-PBS各组分的荧光发射光谱的主峰位于670～672 nm,次峰在578 nm (图14);NTM-PBS各组分的荧光发射主峰在670～671 nm,次峰在578 nm(图15)．由此可见,430 nm激发时TM-PBS和NTM-PBS的各组分表现出的仍然是与图12和图13相似的藻胆体的荧光发射光谱特征,而且含有类囊体膜Chl a-蛋白复合物吸收的TM-PBS藻胆体各组分在690～730 nm之间也没有表现出明显可见的荧光发射峰或肩峰(图14)．此外,图14和图15中～ 501 nm处的弱荧光应来自于Chl a和藻胆蛋白之外的未知成分,有待进一步研究确定．

虽然在荧光发射光谱上含类囊体膜藻胆体TM-PBS组分没有表现出明显的Chl a-蛋白复合物的特征荧光峰或肩峰(图14),但是如图16所示,在430 nm激发时TM-PBS 0.8L与NTM-PBS 0.8L(图16(a))和TM-PBS 1.2L与NTM-PBS 1.2L (图16(b))的荧光差光谱中,在670～740 nm之间有明显的荧光强度差别,且在约700 nm处均有一个差光谱峰．这种差异表明,不用表面活性剂增溶制备的藻胆体TM-PBS组分,如TM-PBS 0.8L和TM-PBS 1.2L,含有来自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物．

2.2.3 不同藻胆体组分的差异性 亚超速密度梯度离心制备出的2种藻胆体样品TM-PBSs (图1(a) 0.2M-Band)和NTM-PBSs (图1(b) 0.2M-Triton-Band),在498 nm R-PE特征吸收激发时,670 nm处藻胆体末端发射体(AP-LCM和AP-B)的强荧光峰 (F670)与578 nm处来自R-PE弱荧光峰(F578) 的相对强度比值大于3,根据路荣昭等提出的鉴别藻胆体完整性的指标,说明用本方法制备的0.2 mol/L梯度带紫色样品属于完整藻胆体,且藻胆体0.2M-Band的吸收值A498/A618、A498/A650大于藻胆体0.2M-Triton-Band (表1)．

表1 不同梯度带藻胆体组分的光谱特性比较Tab.1 The spectral property comparison of the phycobilisome components from the different gradient layers

在超速离心后2种藻胆体样品被分离成位于相同蔗糖梯度层的4个紫红色藻胆体组分(PBS 0.8L、PBS 1.0L、PBS 1.2L、PBS 1.2B)．通过对比发现(表1),与TM-PBSs相比NTM-PBSs样品A498/A618和A498/A650的比值明显较大,可能是不加表面活性剂的样品中叶绿素对618 nm,650 nm处的吸收值有贡献,造成618 nm,650 nm处的吸收值偏大;用波长为498 nm的光激发时,TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L藻胆体的F670/F578的相对最大,其次是TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L,且F670/F578比值均大于或略小于3,而TM-PBS 1.0L、NTM-PBS 1.0L和TM-PBS 1.2B、NTM-PBS 1.2B的F670/F578比值都小于3．这进一步说明,PBS 1.0L、PBS 1.2B是两种不稳定的藻胆体形式,含有解离的藻胆蛋白成分;A498/A618和A498/A650比值偏大的NTM-PBS藻胆体,其荧光强度比值F670/F578也相应较小．

3 讨 论

红藻藻胆体的结构与功能一直是红藻,尤其是海生红藻光合作用研究的主要内容之一．从藻类样品中提取、分离制备具有天然结构状态的藻胆体是从事藻胆体藻胆蛋白与连接多肽组成、藻胆蛋白在藻胆体中的有序组装、藻胆体在类囊体膜上与光系统PSⅠ/PSⅡ的结构联系及其光能传递功能等方面研究工作的必备条件．制备具有完整天然结构藻胆体,需要在材料破碎、藻胆体提取及其分离纯化全过程避免干扰藻胆体内部各成分之间的相互作用,从而破坏其结构的完整性．此外,为研究藻胆体与光系统PSⅡ的结构关系还需避免破坏或干扰藻胆体核-膜连接多肽的结构及其与类囊体膜的接合状态．为此,本研究在前人工作基础上[21,28-29],选用性质最温和的蔗糖密度梯度离心,利用藻胆体与其他组分沉降系数的不同,在亚超速和超速离心条件下,建立了从多管藻藻胆体提取液中高效分离纯化完整藻胆体的密度梯度离心的技术方法．

实验结果表明,在亚超速密度梯度离心条件下(0.1～1.0 mol/L蔗糖梯度,95 000×g3 h),从多管藻藻胆体提取液和Triton X-100增溶藻胆体提取液中,分别制备出均位于0.2 mol/L密度带(图1)的携带类囊体膜藻胆体(0.2M-Band)和不含类囊体膜的藻胆体(0.2M-Triton-Band)．荧光发射光谱(图5)及大于3的F674/F589和F670/F579比值 (表1) 所表现出的高效光能传递证明:亚超速密度梯度离心制备的2种藻胆体0.2M-Band和0.2M-Triton-Band是具有完整结构的多管藻藻胆体．两者的主要差别在于:0.2M-Band藻胆体在约686 nm和700～800 nm处有来自光系统PSⅡ/PSⅠCh a-蛋白复合物的光吸收(图4)和荧光(图5(b)),证明0.2M-Band藻胆体带有与其相结合的类囊体膜PSⅡ/PSⅠ组分,而经Triton X-100增溶处理所得到的0.2M-Triton-Band藻胆体已不含类囊体膜组分．与0.2M-Triton-Band相比,带类囊体膜的0.2M-Band藻胆体更适用于研究类囊体内光系统PSⅡ/PSⅠ与藻胆体之间结构联系及相互作用关系．

蔗糖密度梯度超速离心(0.5～1.2 mol/L蔗糖梯度,136 000×g5 h)后,亚超速离心所得藻胆体0.2M-Band和0.2M-Triton-Band 均被分离成位于相同梯度层的4个组分(图8),其中荧光比值F670/F578大于3(图12—图15,表1)的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L、TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L是结构相对稳定的完整藻胆体,而TM-PBS 1.0L和NTM-PBS 1.0L、TM-PBS 1.2B和NTM-PBS 1.2B是可继续分离成TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L及TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L的不稳定藻胆体组分(图9)．与含量较大的TM-PBS 0.8L和NTM-PBS 0.8L相比,含量较低、密度较大的TM-PBS 1.2L和NTM-PBS 1.2L应为前两者的部分复合物．TM-PBS和NTM-PBS 2类藻胆体的主要差别仍然主要表现在,前者含有来自PSⅡ/PSⅠ的Chl a-蛋白复合物,而后者不含Chl a-蛋白复合物 (图11、12和16)．

与常用的超速密度梯度离心方法相比,本研究以海生大型红藻多管藻为材料所建立的亚超速密度梯度离心方法不仅降低了仪器设备的使用成本,而且大大缩短了离心时间,有效提高了藻胆体的制备效率．本实验在无表面活性剂增溶条件下所分离制备的含有类囊体膜组分的藻胆体,如0.2M-Band及TM-PBS 0.8L和TM-PBS 1.2L,不仅可用于藻胆体藻胆蛋白组成、藻胆体有序组装及光能传递研究,而且更适合用于研究藻胆体与光系统PSⅡ/PSⅠ结构联系及其相互作用关系．此外,将亚超速蔗糖密度梯度离心制备多管藻完整藻胆体及超速蔗糖密度梯度离心分离纯化藻胆体不同梯度带组分的技术方法,用于海生大型红藻江蓠的藻胆体制备与分析也得到了相同的实验结果,表明该技术方法还可拓展用于其他大型红藻藻胆体的制备与组分分析．综上所述,本研究所建立的海生大型红藻完整藻胆体的分离制备与分析技术方法,可为海生红藻藻胆体结构与功能研究提供有力的技术支持．