唐古红景天干预肺动脉高压作用机制的网络药理学研究※

华玉美多，南星梅，杨占婷，苏姗姗，李占强*，芦殿香**

[1.青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016；2.青海大学高原医学研究中心，高原医学教育部重点实验室，青海省高原医学应用基础重点实验室(青海-犹他高原医学联合重点实验室)，青海 西宁 810001；3.青海大学医学院，青海 西宁 810001；4.西宁海关技术中心，青海省食品安全研究重点实验室，青海 西宁 810003]

课题组前期研究发现，唐古红景天活性部位具有显著的血管舒张活性，能够显著干预低氧性肺动脉高压的形成；并明确了活性部位的主要化学成分。[1-3]尽管对其作用机制进行了一些研究，但仍不清晰。基于此，本研究借助网络药理学方法构建“成分-靶点-通路”网络，以期揭示唐古红景天干预肺动脉高压的具体作用机制，为后续深入研究提供线索。

1.资料与方法

1.1 网络药理学相关数据库及软件

Swiss Target Prediction数据库(网址：http：//new.swisstargetprediction.ch/)[4]；PubChem数据库(网址：https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Genecard数据库(网址：https：//www.genecards.org/)[5]；UniProt数据库(网址：https：//www.uni prot.org/)；STRING数据库(网址：https：//string-db.org/)；KEGG数据库(网址：http：//www.genome.jp/kegg)。Venny2.1.0软件；Cytoscape3.6.1软件。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物的筛选与靶点预测

借助PubChem数据库获取唐古红景天活性部位38个主要成分的化学结构(SMILES格式)，并导入Swiss Target Prediction服务器进行靶点预测，并以靶点相关概率值≥0.2为标准[6]筛选化合物及相关靶点。利用Perl语言通过UniProt后台数据库进行靶点基因注释。登录GeneCards网站，以“pulmonary hypertention”“pulmonary arterial hypertention”“hypoxic pulmonary hypertention”为关键词进行检索获得肺动脉高压疾病相关靶点，获取相关度得分最高的500个靶点，并通过UniProt数据库进行靶点基因验证。将获得的唐古红景天化学成分预测靶点与肺动脉高压疾病相关靶点运用Venny 2.1.0软件绘制韦恩图，获得唐古红景天干预肺动脉高压的作用靶点。

1.2.2 蛋白互作网络(PPI)的构建与分析

登录STRING数据库，选择“Multiple protenis”项分析，上传唐古红景天干预肺动脉高压的作用靶点，选择物种为“Homo sapiens”，筛选综合评分≥0.4的蛋白相互作用参数，其他参数为默认参数，获得药物-疾病蛋白互作网络图及TSV文本数据。利用R语言对得到的蛋白互作网络进行蛋白互作次数分析。

1.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

借助R语言调用“org.Hs.eg.db”(人类全基因组注释)程序包将基因symbol转化为基因ID，再借助R语言调用bioconductor(http：//www.bioconductor.org/install/)[7]软件包中的“dose”“clusterProfiler”“pathview”开放源代码并结合KEGG数据库及Perl语言进行作用靶点的GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.4 “化合物-靶点-通路”网络构建

整理化合物-靶点、靶点-通路的相互对应关系，使用Perl对节点数据进行属性标识，获得节点属性文件。并将所得数据导入Cytoscape 3.6.1软件，进行参数设置。得到唐古红景天活性成分干预肺动脉高压的“化合物-靶点-通路”相互作用网络图。

2.结果

2.1 唐古红景天活性成分干预肺动脉高压的潜在靶点筛选

通过Swiss Target Prediction服务器利用反向药效团匹配方法，获得唐古红景天活性部位主要化学成分的141个作用靶点(probability value≥0.2)。利用Venny 2.1.0软件将141个作用靶点与从GeneCards数据库获取的前500个肺动脉高压疾病相关靶点进行交集筛选，获得唐古红景天干预肺动脉高压潜在作用靶点(图1)及其化合物与作用靶点信息(表1)。

图1 唐古红景天-肺动脉高压共同靶基因的韦恩图

表1 唐古红景天化合物对应靶基因信息表

2.2 唐古红景天活性成分蛋白互作网络PPI的构建与分析

为进一步分析唐古红景天干预肺动脉高压的作用机制，在STRING数据库录入38个靶蛋白，绘制蛋白互作网络PPI图(图2)。该网络中38个靶点都存在相互作用，无游离蛋白，38个节点相互作用产生了251条蛋白互作边，平均节点度数为13.2。其中互做边最多的20个靶点如图3所示，TNF、AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9、MAPK14、ESR1、HRAS等节点蛋白互作次数显著高于其他节点，提示这些靶蛋白在互作网络中比较重要，推测其可能是唐古红景天干预肺动脉高压的关键靶点。

图2 蛋白互作网络图

图3 核心靶蛋白柱状图

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Omicshare(https：//www.omicshare.com/tools/index.php/)[8]云平台对相关靶点蛋白进行GO功能分析。结果表明38个相关靶蛋白共参与了962个GO的生物过程(P<0.01)，涉及到23个BP(Biological Process，BP)相关条目、8个MF(Molecular Function，MF)相关条目及15个CC(Cellular Component，CC)相关条目(图4)。进一步分析发现，这些靶蛋白在BP中主要参与了“对内外源性刺激的反应”“机体代谢过程”“调节生物过程”“细胞过程及信号通路”等相关二级分类条目。在MF过程中主要参与了“抗氧化活性”“分子功能调节”“转录调节活性”“离子结合”“蛋白结合绑定”“酶催化活性”等主要二级分类条目。在CC过程中这些蛋白主要参与了“细胞器”“细胞内膜系统”“膜封闭腔”“细胞连接”“突触”“囊泡”“胞外基质”等二级分类条目。综合筛选BP+MF+CC三部分中P值最小的前25个GO功能过程进行可视化处理(图5)。统计发现前25个功能过程中38个靶点平均富集程度比率达55.65%，最高富集比率达85.7%。

图4 GO功能二级分类柱状图

图5 GO功能富集分析气泡图

通过KEGG通路富集筛选、分析共得到相关通路192条，对获得的通路进行数目统计(图6)，并进行注释和靶点数目统计。发现192条通路涉及5大类A级通路及其所属的30类B级通路。主要涉及到免疫、呼吸、神经、内分泌四大系统；脂质、蛋白质代谢及与细胞生长、增殖、凋亡相关的信号转导通路。对KEGG通路富集分析结果进一步筛选发现，P≤0.01的通路有7条，主要涉及C-型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、GnRH信号通路(GnRH signaling pathway)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)和内分泌抵抗信号通路(Endocrine resistance)等。此外还涉及肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、缺氧诱导因子-1信号通路、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路、AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路及与炎症免疫相关的花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)信号通路等。推测唐古红景天干预肺动脉高压的机制可能与干预以上通路过程有关。其中，根据相关度及P值筛选出前29条信号通路(图7)。

纵坐标黑色字体表示KEGG A级通路，彩色字体表示该A级通路下所属具体的B级通路，横坐标表示该通路中富集的基因的数量

图7 KEGG富集分析气泡图

2.4 “化合物-靶点-通路”网络构建

利用Cytoscape 3.6.1软件，根据“化合物-靶点”“靶点-通路”的对应关系，构建“化合物-靶点-通路”的网络关系图(图8)。14个黄色节点表示化合物，38个红色节点代表预测蛋白靶点，30个绿色节点表示相关通路。结果显示，网络关系既存在一对多，也存在多对一，其中化合物山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、对香豆酸(p-coumaric acid)、咖啡酸(caffeic acid)、(-)-表儿茶素没食子酸酯[(-)-epicatechin-3-O-gallate]、红景天苷(salidroside)等化合物具有明显的多靶点/多通路的作用特征，初步阐释了唐古红景天干预肺动脉高压的活性物质及作用机制。

图8 化合物-靶点-通路网络图

3.讨论

红景天成分复杂，药理作用广泛，极具开发潜力。现代药理学研究已表明红景天具有干预肺动脉高压的药理作用，但其发挥作用的具体机制并不完全清楚。

课题组前期对唐古红景天干预低氧性肺动脉高压的活性部位及其抗增殖机制的研究结果显示，其活性部位可以抑制慢性低氧引起的肺动脉压力升高，并通过降低PCNA、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白CDK4的表达水平抑制p27Kip1降解进而抑制PASMCs的增殖，从而发挥抑制血管重构的作用[1]。

本研究运用网络药理学方法，并结合生物信息学对唐古红景天活性部位主要化学成分干预肺动脉高压的可能作用机制行深入探讨。筛选出有效化学成分14个、干预肺动脉高压的有效靶点38个。GO功能分析结果表明，唐古红景天可能主要通过干扰机体对内外源性刺激的反应、机体代谢、分子功能调节、蛋白结合绑定、离子结合及与细胞增殖、迁移、凋亡、程序性死亡相关的具体功能过程而发挥保护作用。KEGG通路富集筛选分析结果显示，主要涉及“内分泌及代谢疾病”“免疫系统”“神经系统”“信号转导”“细胞的生长和凋亡”“脂质代谢”等六大类相关通路。

其中Liu J等人的研究发现IL-33可通过上调血管内皮细胞中的HIF-1α和VEGF表达来启动低氧性肺动脉高压的血管重塑[9]；TNF-α在慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠血管重构中发挥作用，Liu WY等人的研究发现通过激活NF-κB/TNF-α途径可以保护大鼠肺动脉高压[10]；越来越多的实验数据表明AMPK联级信号通路在血管动态平衡中起着至关重要的作用，Wang HL等人最新的研究表明AMPKα2敲低可促进缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖，这种现象伴有Skp2上调和p27kip1表达下调，并能够被雷帕霉素(mTOR抑制剂)调控，即增强对AMPKα2活性的控制可能是肺动脉高压的新治疗策略基础[11]。此外KEGG分析结果中所显示的PI3K-Akt、JAK-STAT、IL-17、FoxO、Ras等多条信号通路均已证实与肺动脉高压的形成、发展及治疗有关[12-16]。

目前已被研究证实具有干预肺动脉高压作用的红景天化学成分有红景天苷、槲皮素、异槲皮苷、芦丁、儿茶素等[17-26]。研究发现红景天苷能够通过AMPKα1-P53-P27/ P21途径抑制慢性缺氧诱导的PASMCs增殖，并通过AMPKα1-P53-Bax/ Bcl-2-caspase 9-caspase 3途径逆转凋亡抗性[19]；可通过AKT /GSK3β信号通路抑制血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导的PASMCs增殖[20]；可通过上调AMPK-mTOR-ULK1途径的自噬而减轻缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡抗性以及通过影响HIF- 1α进而对肺血管收缩及重建起作用[21-22]。槲皮素能够呈剂量依赖性方式抑制缺氧低氧下TrkA/AKT信号级联的激活，并能单独抑制TrkA/AKT信号传导途径，进而减少PASMCs迁移，阻滞细胞周期并诱导凋亡[23]；还能够通过Akt和Erk1/2途径抑制肺动脉内皮细胞(PAEC)转分化从而有效治疗肺动脉高压[24]；槲皮素还可通过FOXO1-SENS3-mTOR信号通路增强缺氧诱导的PASMCs自噬[25]。异槲皮苷可抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖，下调细胞周期蛋白D1和CDK4的表达，并抑制p27Kip1的降解，并对PDGF-BB诱导的PDGF-β、Akt/GSK3β和ERK1/2磷酸化产生负调节作用，引起G0/G1期细胞周期停滞[26]。根据“化合物-靶点-通路”网络可知，唐古红景天活性部位中槲皮素、山奈酚、对香豆酸、咖啡酸、红景天苷等化合物作用靶点及通路较多，存在单组分-多靶点、多组分-单靶点的特点，部分机制已被相关研究所证实，为深入阐明唐古红景天干预肺动脉高压的多组分-多靶点机制，以及开展各活性成分间相互作用(协同、叠加、拮抗)研究提供了思路。