HPLC法同时测定儿童清热口服颗粒剂中3种有效成分的含量

平 静 南春红 王思源 岳志军

儿童清热口服颗粒剂是临床上常用的治疗药物，主要由金银花、滑石、蝉蜕、大黄、赤芍、板蓝根等组成，以蔗糖为辅料，具有清热解毒、解肌退热作用[1]。现代药理结果表明[2]：儿童清热口服颗粒剂用于内蕴伏热、外感时邪引起的高热不退、烦躁不安及大便秘结等症中。但是，临床上不同厂家儿童清热口服颗粒剂质量存在明显的差异性，尽管能改善患儿症状，但是不同厂家药物有效性、安全性不同。高效液相色谱法简称HPLC，是在经典液相色谱法的基础上，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法[3]。因此，本实验首次建立HPLC同时测定儿童清热口服颗粒剂中3种有效成分含量，为其质量标准的建立及进一步开发利用提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大连依利特分析仪器有限公司)；KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XP205电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；0.45 μm微孔滤膜；进样针；移液管；注射器；托盘天平。

1.2 试剂 儿童清热口服颗粒剂，批号：14262461、14261321、14261877；色谱乙腈(济南普莱华化工有限公司)(批号：20130318)；纯净水(自制)；磷酸等化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 采用HPLC法，色谱柱为：Kromasil C18色谱柱为(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱0～7 min，10.0%A；7～12 min，10.0%～20%A; 12～13 min,20.0%～30%A; 13～26 min,30%～65%A; 26～35 min,60%～70%A; 35～45 min,10%A。线性洗脱检测波长0～18.5 min，327 nm; 18.5～20 min, 238 nm; 20～23 min, 321 nm; 23～45 min, 280 nm，设定流速为1.0 ml/min；柱温为28 ℃，选择波长切换技术在其最大吸收波长部位检测绿原酸(波长327 nm)、芍药苷(波长230 nm)及黄芩苷含量(波长280 nm)[4]。

2.2 对照试验的配置 精确称取对照品剂适量，加甲醇溶解配置成浓度为0.1020 mg/ml绿原酸、芍药苷、黄芩苷混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 精确称取儿童清热口服颗粒剂适量，置具塞锥形瓶中，按料液比为1∶20加入80%的乙醇，超声2次提取，温度60 ℃，时间50 min，过滤，合并滤液，蒸干，加入20 ml蒸馏水溶解，加入(20 ml，20 ml)的正丁醇萃取二次，取正丁醇层，旋干，加入少量甲醇溶解，分别置于10 ml的容量瓶中，加入甲醇定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品。

2.4 精密度实验 取儿童清热口服颗粒剂连续进样5次进行测定，分别对共有峰保留时间和峰面积进行统计，计算RSD值，结果发现它们的相对标准准偏差(RSD)均小于3%，因此，结果表明该仪器具有良好的精密度。见表1。

2.5 稳定性实验 取儿童清热口服颗粒剂按照2.1含量测定的色谱条件分别上样(8、10、12、14、16、18、20 μl)，以上样量和峰面积做标准曲线。见表2。

表1 精密度考察结果

表2 稳定性实验考察结果

结果显示：儿童清热口服颗粒剂中绿原酸回归方程：Y=20.662X+19.211，R2=0.9994，R=0.9997；芍药苷回归方程：Y=4.56194×107X-0.00247367，R=0.9999，R2=0.9998；黄芩苷回归方程：Y=5.59922×107X-0.002392863，R2=0.9997，R=0.9998。

2.6 重现性实验 取儿童清热口服颗粒剂3号供试品5份，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件进行测定，统计各共有峰的保留时间和峰面积，计算RSD值。结果表明它们的相对标准偏差(RSD)均小于3%，因此表明该仪器的重现性良好。见表3。

2.7 稳定性实验 取儿童清热口服颗粒剂供试品，在0、2、4、8、12 h依次进样测定，统计各共有峰的保留时间和峰面积，计算各共峰的RSD值。结果表明它们的相对标准偏差(RSD)均小于3%，因此说明该仪器在12 h内的稳定性良好。见表4。

表3 重现性考察结果

表4 稳定性考察结果

3 结果

儿童清热口服颗粒剂中，14262461批号绿原酸含量为2.350 mg/g，芍药苷含量0.7152 mg/g，黄芩苷含量3.7025 mg/g；14261321批号绿原酸含量为2.172 mg/g，芍药苷含量0.8571 mg/g，黄芩苷含量3.853 mg/g；14261877批号绿原酸含量为2.639 mg/g，芍药苷含量0.7934 mg/g，黄芩苷含量4.152 mg/g。见表5。

表5 样品中绿原酸、芍药苷及黄芩苷含量

4 讨论

中药复方制剂成分较为符合临床上建立多指标成分测定、合理可行的指纹图谱相结合的质量控制及生物检测方法成为当前研究的热点，其中多指标成分测量是中药复方制剂质量控制的核心[5]。儿童清热口服颗粒剂是临床上常用的治疗药物，主要由金银花、大黄、蝉蜕、石膏、板蓝根、羚羊角等组成，能发挥清热泻火、解肌退热功效[6]。目前，临床上对于儿童清热口服颗粒剂其治疗标准多以草酸铵试液法鉴别石膏，并借助硅胶G薄层色谱法鉴别大青叶、相对密度及pH值等，但是临床上对于儿童清热口服颗粒剂有效成分测量方法研究较少[7]。本研究中，儿童清热口服颗粒剂中，14262461批号绿原酸含量为2.350 mg/g，芍药苷含量0.7152 mg/g，黄芩苷含量3.7025 mg/g；14261321批号绿原酸含量为2.172 mg/g，芍药苷含量0.8571 mg/g，黄芩苷含量3.853 mg/g；14261877批号绿原酸含量为2.639 mg/g，芍药苷含量0.7934 mg/g，黄芩苷含量4.152 mg/g，说明HPLC法用于儿童清热口服颗粒剂有效成分是可行的，能了解不同批次下儿童清热口服颗粒剂的有效成分，有助于提高临床用药安全性。绿原酸是金银花的重要成分之一，具有抗菌、抗病毒等作用，易溶于乙醇、丙酮，药物成分与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时能提高机体中枢兴奋性，能发挥利胆、抗菌作用，亦可用于气喘、皮炎中。芍药苷主要源于芍药科植物芍药根、牡丹根中，具有扩张血管，发挥镇静镇痛、抗炎抗溃疡及解热解痉及利尿作用[8]。同时，芍药苷对心血管系统亦可发挥良好的效果，具有扩张冠状动脉，提高冠脉流量作用，药物亦可抑制血小板及降低血压作用。黄芩苷是从干燥根中分离、提取的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性，能发挥抑菌、利尿、抗炎等作用，亦可发挥抗血栓形成、泻火解毒、止血及解痉作用，能实现某些疾病的调节作用[9]。绿原酸、芍药苷及黄芩苷是儿童清热口服颗粒剂中有效成分，能发挥清热解毒作用，但是临床上对于其质控标准研究较少。HPLC又称为高速液相色谱、高分离度液相色谱，是色谱法中的重要分支，以液体为流动相，利用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂等装有固定相的色谱柱，置入检测仪后能实现对样本的测定。临床研究表明：HPLC用于儿童清热口服颗粒剂中具有高压、高速、高灵敏度、应用范围广及柱子能广泛使用等优点，测定时所需的样本量相对较少，能较为准确地反映儿童清热口服颗粒剂有效成分，有助于指导临床用药[10]。从本研究结果看出，不同批次的儿童清热口服颗粒剂不同有效成分存在明显的差异性，应建立儿童清热口服颗粒剂统一药物标准，提高药物有效成分剂量，提高临床用药安全性。同时，医院购置药物时应定期监测药物批次，做好相关药物的抽查工作，提高药物含量，保证临床用药安全性。

综上所述，HPLC法用于儿童清热口服颗粒剂中3种有效成分含量测定，具有简便、快速、准确等优点，可用于儿童清热口服颗粒剂的质量控制。