基于三维荧光光谱检测水产品中隐性孔雀石绿残留量

李宁驰，任诺钰 ，刘春宇，2* ，姚治海，2，蔡红星

1. 长春理工大学理学院光谱探测科学与技术省重点实验室，吉林 长春 130012 2. 吉林省求是光谱数据科技有限公司，吉林 长春 130012

引 言

水产品因其营养和药用价值被人们广泛接受，我国2018年的水产品年产量已超过7 000万吨。然而，在如此巨大的消费量和产量下却存在着一个重大问题，即有个别不法商家使用国家禁用药物孔雀石绿作为杀菌剂。

孔雀石绿(Malachite green，MG; 分子式: C23H25N2Cl)是一种三苯甲烷类物质[1]。作为一种工业染料[2]，因其具有良好的杀菌能力，被用于水产品的养殖和保鲜。[3]但据相关研究人员表明, 孔雀石绿及隐性孔雀石绿对哺乳动物组织具有不可逆的损伤，故而许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。

孔雀石绿化学性质不稳定，在进入动物机体后，会快速代谢成相对稳定的具有亲脂性的无色隐性孔雀石绿(Leuco-malachite green，LMG; 分子式: C23H26N2)，LMG可轻易地透过动物组织的间隙，且 LMG本身具有高毒性，对哺乳动物有致癌、致畸等危害，因其亲脂性和不易分解的特点，LMG易在人体内积蓄，对人类健康会产生长期的威胁[4]。因此，研究一种针对水产品中MG及LMG残留的方便快捷的检测方法具有重要意义。

图1 孔雀石绿分子结构图Fig.1 The molecular structure of MG

图2 隐性孔雀石绿分子结构图Fig.2 The molecular structure of LMG

经过科研人员的不断研究，国际市场上已有多种检测方案，较为常见的有高效液相色谱法[5]、紫外光谱法[6]，此外还有检测精度较高的分子印迹技术[7]、表面增强拉曼光谱技术[8]、传感器检测法[9]等； 然而高效液相色谱法虽然应用广，但检测周期长、操作复杂，紫外光谱法检出限较高, 测定结果易受实际样品中基体干扰[6]，分子印迹技术和表面增强拉曼光谱技术特异性强但检测成本高，前期准备复杂。相比之下，三维荧光光谱检测法有低成本、方便快捷等优势，但由于MG荧光性弱，该方法进展缓慢。

不过，虽然MG为弱荧光物质，但MG在动物体内代谢物LMG荧光性强，且易在鱼类脂肪中积累。通过三维荧光光谱检测法，可快速精准、高效简便的检测LMG的含量，由此分析出水产品是否被非法添加MG。其便捷性、低成本、易操作的特点可以满足我国的检测需要。本文将围绕三维荧光光谱检测技术，讨论LMG的最佳检测条件及其可行性，旨在提供一种针对水产品中MG和LMG残留的检测新思路。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

LMG标准品(纯度>98%，阿拉丁试剂(上海)有限公司)； 乙醇、甲醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、甘氨酸、氢氧化钠(北京化工厂)； 新鲜龙利鱼切片(长春前进广场沃尔玛超市)； 去离子水。

天津拓普WFY-28型荧光分光光度计(光源为150 W氙灯，激发波长范围220～760 nm，发射波长范围220～760 nm)。

1.2 方法

1.2.1 LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的三维荧光光谱测定

准确称取两份0.5 g LMG标准品，分别以乙醇、甲醇为溶剂配制成1 mg·mL-1LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液各500 mL。

取2 mL待测液于比色皿内，置于光谱仪中； 选定发射光谱扫描，设置发射狭缝、激发狭缝、发射单色器波长范围等参数； 在激发波长295～330 nm范围内对储备液进行三维荧光光谱测量； 整合数据，制作三维荧光光谱。

1.2.2 LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的最佳检测条件的测定

分别配制pH值为3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0，7.4和8.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液，以及8.6，9.0，9.4，9.8，10.2的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液各50 mL，作为梯度缓冲液保存。

分别取LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液2 mL，加入18 mL某pH值缓冲液，溶液变为浑浊，摇匀，溶液成乳白色。参考此方法配制系列pH值LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液共34份，密封保存。

调整光度计各项参数，设置激发波长为320 nm，分别对系列pH的LMG溶液和缓冲液进行荧光光谱检测，得到数据并保存； 以pH值为x轴，荧光峰峰值强度(intensity)为y轴，制作荧光峰峰值强度随pH变化曲线。

1.2.3 稳定性分析

将浓度为 1 mg·mL-1的LMG-乙醇标准储备液，用乙醇稀释为浓度1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1和0.01 mg·mL-1的系列浓度乙醇稀释液。密封保存； 用pH7.0的缓冲液将系列浓度的稀释液准确稀释10倍，配制成浓度为0.1，0.08，0.06，0.04，0.02，0.01和0.001 mg·mL-1的系列浓度标准稀释液； 调整光谱仪各项参数，设置激发波长为320 nm对系列浓度的标准稀释液进行测量，得到数据并保存，以LMG标准溶液的浓度(mg·mL-1)为x轴，以平均峰值作为y轴，制作LMG的标准曲线。

1.2.4 对鱼肉样品的测定

在无菌条件下，将龙利鱼鱼肉分割成若干份长宽高约为20 mm×10 mm×2 mm的长方体，分别用浓度为0.1，0.08，0.04，0.02和0.01 mg·mL-1的不同浓度的LMG-乙醇稀释液浸泡十分钟，并取一份用酒精浸泡十分钟作为空白对照组。调整光谱仪各项参数，设置激发波长为320 nm对各组鱼肉样品进行测量，每组测量三次，并保存数据，以LMG-乙醇稀释液的浓度为x轴，以荧光峰平均峰值作为y轴，制作鱼肉样品荧光峰平均峰值的标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 LMG的三维荧光光谱分析

分析整理实验1.2.1的数据，得到LMG-乙醇溶液三维荧光光谱图，如图3所示； LMG-甲醇荧光光谱图，如图4所示。

图3 LMG-乙醇溶液三维荧光光谱图Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectraof LMG-ethanol solution

由实验结果可知，在发射波长340～440 nm、激发波长290～330 nm的范围内，LMG-乙醇溶液有一个明显的荧光峰peak1(激发波长320～326 nm/发射波长350～362 nm)，最高峰值max 1在激发波长324 nm/发射波长355 nm处。

LMG-甲醇溶液同样有且只有一个荧光峰peak2(激发波长317～323 nm/发射波长342～362 nm)，最高峰值max2在激发波长320 nm/发射波长355 nm处。

乙醇和甲醇也具有各自的荧光峰，其中乙醇荧光性弱，对本实验干扰可忽略，甲醇有两个荧光峰，分别位于225/350 nm和250/375 nm处，与peak2的位置没有冲突，故而可以判定peak1和peak2为LMG的荧光峰，可作为进一步讨论依据。

图4 LMG-甲醇溶液三维荧光光谱图Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectraof LMG-methanol solution

2.2 pH变化对LMG荧光效果影响

LMG在不同的pH环境中所呈现的荧光峰强度和效果不尽相同，通过实验1.2.2整理得到的荧光峰峰值强度平均值随pH变化曲线，来探究LMG的最佳检验pH环境。

图5 LMG-乙醇溶液荧光峰峰值强度平均值随pH变化曲线

Fig.5 The curve of the average fluorescence peak intensity of LMG-ethanol solution with the change of pH value

图6 LMG-甲醇溶液荧光峰峰值强度平均值随pH变化曲线

Fig.6 The curve of the average fluorescence peak intensity of LMG-methanol solution with the change of pH value

检测得，实验所用缓冲液基本无荧光，可忽略其荧光影响。因此可以判定本实验所用缓冲液只能提供不同pH环境，而对LMG的检测无影响。

由图5和图6可得，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液荧光强度在pH值3.4～10.4范围内有一个峰，且在pH 7.0时达到最高，可以判定，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液均在pH 7的环境中最适合荧光光谱检测。淡水养殖池塘的水体pH一般在7～8.5左右[10]，该环境下LMG有较强的荧光效果，故而用荧光光谱检测法检测水产品中的LMG有良好的适应性，无需对待测样品进行繁琐的前期处理。

2.3 稳定性分析

为进一步验证荧光峰强度和LMG浓度的关系，设计实验1.2.3，收集数据，以LMG标准溶液的浓度(mg·mL-1)为x轴，以平均峰值作为y轴，制作并得到LMG的标准曲线(图7)，得到回归方程y=491.780 82x+7.224 66, 相关系数r=0.970 87，根据线性拟合的相关系数r可知，LMG浓度和荧光峰强度具有良好的线性关系，因此，可以说明LMG的荧光光谱检测法有较好的稳定性，可以用于LMG浓度的测定，计算得回收率为94.546%，这表明三维荧光光谱法检测LMG有较高的精度。

图7 LMG标准曲线Fig.7 Standard curve of LMG

2.4 鱼肉检测分析

在确定了LMG的荧光峰位置和荧光效果与pH的关系后，设计实验1.2.4对鱼肉样品在中性环境中进行检测，以进一步验证本检测方法的可行性。整理实验数据制作鱼肉样品荧光强度随隐性孔雀石绿浓度变化的标准曲线(图8)，得到回归方程y=313.191 13x+3.301 54，相关系数r=0.989 77, 由相关系数可知： 鱼肉样品中LMG浓度和荧光峰强度具有良好的线性关系，因此，三维荧光光谱检测法可以检测鱼肉样品中LMG，并分析其浓度。计算得鱼肉样品的回收率为96.65%，表明三维荧光光谱法对鱼肉样品中LMG的含量检测有较好的灵敏性，更加证明了该方法的可行性。

相比于应用广泛的高效液相色谱法[11](回收率66.01%～76.34%)及其衍生方法，如柱前电化学衍生法[12]、液质联用法[13]、液相色谱-紫外荧光法[14]等，三维荧光光谱检测法有较为可观的精度和操作简单的优势，而对比与以高精度为特点的分子印迹技术[7]、传感器检测[9]、CdTe量子点表面分子印迹荧光探针技术[15]等方法，本方案在保证良好精度的同时具有方便快捷、取样简单、测量周期短、成本低等优势，更适合广泛的应用于对水产品中LMG的检测和浓度分析。

图8 三维荧光光谱法测得不同浓度LMG处理后鱼肉样品的荧光强度图Fig.8 Standard curve of fish samples were obtained bythree-dimensional fluorescence spectroscopy

3 结 论

在发射波长340～450 nm范围内，LMG-乙醇和LMG-甲醇溶液的三维荧光光谱且只有一个峰，分别位于peak1(激发波长320～326 nm/发射波长350～362 nm处)、peak2(激发波长317～323 nm/发射波长342～362 nm处)，可以确定该荧光峰为LMG荧光，激发波长320 nm/发射波长355 nm左右为LMG最佳吸收波长。三维荧光光谱法检测LMG在pH 7.0的环境下荧光效果最好，且缓冲液荧光干扰可忽略不计，证明该方法在用于水产品的检测时无需对样品特殊处理就可得到最佳检测效果。LMG溶液和鱼肉样品的荧光效果和LMG浓度有良好的线性关系，相关系数分别为0.970 87和0.989 77, 接近于1，回收率为94.546%和 96.65%，证明该方法适于水产品中LMG浓度的分析检测，且精度较高。

对比市场上已有的对于水产品中隐性孔雀石绿的检测方法，三维荧光光谱法因其高精度、取样简单、方便快捷、低成本等特点，更有利于解决我国水产品质检存在的待测样品多、检测成本高等问题，可进一步提高质检效率，缓解质检压力，有望成为新一代检测方法投入使用。