接种乳酸菌制作发酵型甘蓝泡菜过程的研究

隋明，李俊儒，张凤英，吴霞，谢慧蓉，杨晨

(1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830；2.加拿大阿尔伯塔大学 农业与食品营养科学学院，埃德蒙顿 加拿大 T6G2R3)

甘蓝尤其是羽衣甘蓝(Brassicaoleraceavar. acephala f. tricolor)是一种口感香脆、营养丰富的蔬菜，其含有Fe、Ca和胡萝卜素、VC等多种微量元素以及矿物质[1]。此外，甘蓝类蔬菜还含有比其他蔬菜更高含量的蛋白质，被认为是可食用率高、纤维素含量丰富、食用范围最广的蔬菜之一[2]。将蔬菜做成泡菜不仅可以佐餐，还能够减少因萎蔫、腐烂导致的浪费，而且有关研究人员发现泡菜还有一些特殊的功能如其可以逆转脱发等[3]。但因泡菜的生产工艺及原材料等方面原因，制作具有较好香气[4,5]和口感的健康泡菜取决于很多因素如：优良的乳酸菌菌种、亚硝酸盐含量的控制等[6,7]，尤其优良的发酵菌种是至关重要的，其次是不同的发酵条件对泡菜产品的硝酸盐、总酸、风味化合物等物质生成的影响成为目前泡菜研究中的主要课题[8]。泡菜发酵的基本原理是：首先，将乳酸菌加入到发酵陶坛中，再加入经过前处理的蔬菜，使发酵蔬菜具有独特的风味和口感；其次，加入食盐，均匀渗透到蔬菜内部，使组织内的水分被渗透压调整，提高脆度和口感等；最后，通过发酵过程中的各种物理和化学过程，该反应产生泡菜产品的独特风味、颜色和质地。目前泡菜的生产与加工几乎都是通过人工接种，可以将发酵基质中的乳酸菌形成优势菌，避免杂菌的生长[9]。

本试验通过以羽衣甘蓝为泡菜的主要原料辅以其他佐料，通过接种乳酸菌考察了在自然发酵和接种发酵条件下亚硝酸盐含量、pH、酸价的变化，以期通过对照，确定羽衣甘蓝泡菜发酵的最佳工艺参数。

1 试验材料

1.1 试验材料

甘蓝：都江堰市售羽衣甘蓝；纯净水：都江堰蓝光纯净水厂；泡菜盐(川晶泡菜盐)：四川盐业总公司；冰糖(千柏山牌单晶水塘)：云南绫悦轩食品有限公司；生姜(都江堰市售干姜)、胡椒粉(醇禾白胡椒粉)：泰州市永泰食品有限公司；冰乙酸：天津致远化学试剂有限公司；亚硝酸钠标准品：中科北京仪器耗材标准物质中心。

1.2 接种泡菜发酵工艺

试验的接种型泡菜甘蓝制作流程图见图1。将羽衣甘蓝洗净、沥水，切成2 cm×5 cm小长条，在烘箱中在40 ℃条件下烘干，烘干后放入已经接入乳酸菌(植物乳杆菌/鼠李糖乳杆菌)的泡菜陶坛中，进行泡菜发酵。

图1 泡菜工艺流程图Fig.1 Process flow chart of pickle

2 试验方法

将泡菜在自然发酵条件下进行发酵，并在30 ℃下采用接种乳酸菌的方式进行发酵，两者做对照比较相关指标。分别考察发酵5 d、不同菌种比例、不同接种量、发酵温度、蔗糖添加量和食盐添加量对甘蓝泡菜基质中亚硝酸盐含量、pH和酸价的影响。

2.1 亚硝酸钠测定方法

参照国家标准GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，使用离子色谱法进行测定，取部分甘蓝泡菜试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以KOH为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器或紫外检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。

2.2 总酸含量测定方法

参照国家标准GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采集泡菜样品不少于200 g，放置于组织搅碎机中，加入与样品等量煮沸过的纯净水，用研钵捣碎，混合均匀后放置在洁净的烧杯中，从中精确取出50.000 g样品，用煮沸的水将烧杯中内容物全部转移到250 mL容量瓶中，放置于沸水浴中煮沸，并摇动若干次，用快速滤纸过滤，收集滤液，用于测定。

3 结果与讨论

3.1 自然发酵与接种乳酸菌发酵的前期时间比较

在自然富集菌种和接种乳酸菌的甘蓝泡菜发酵5 d后，测定亚硝酸盐含量、pH值和总酸，结果见表1。

表1 天然发酵和接种发酵之间的指标比较Table 1 Comparison of indexes between natural fermentation and inoculation fermentation

由表1可知，发酵5 d后人工接种发酵泡菜基质中的亚硝酸盐含量明显低于自然发酵，pH值也低于自然发酵，总酸量小于自然发酵。亚硝酸盐是一种致癌化学物质，是发酵类型食品能否出厂的一个重要指标，通过自然发酵获得的泡菜产品具有高亚硝酸盐含量。通过本小节试验可以得出结论，为了保证泡菜产品的安全性，应选择人工接种发酵。贾庆超等模拟了自然发酵的条件下发酵不同类型蔬菜，通过考察不同发酵时间内的亚硝酸盐含量，确定其适合食用的时间和亚硝酸盐变化规律[10]，其试验结果表明不同类型的蔬菜在冷藏相同时间内硝酸盐含量是不同的，苤蓝泡菜中亚硝酸盐含量较低。而周强通过考察大白菜发酵过程中不同时间内亚硝酸盐含量，发现总酸、亚硝酸盐含量均在发酵的第5天或第7天出现最高值[11]，该试验结果同本试验结果相同，说明发酵型泡菜在发酵5～7 d时不宜食用。

3.2 不同菌株配比对泡菜发酵的影响

分别向甘蓝泡菜基质中接入鼠李糖乳杆菌∶植物乳杆菌的比例，考察甘蓝泡菜成品的颜色、香气、味道和质地的评分，确定接种菌株的比例。

表2 不同菌株的泡菜质量综合评分表Table 2 Comprehensives scoring table of pickle quality fermented by different strains

图2 不同菌株的比例对泡菜质量的影响Fig.2 Effect of the proportions of different strains on the quality of pickle

由表2和图2可知，在鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的接种率为1∶0、1∶1、0∶1的情况下发酵泡菜，并对产品进行感官评价。结果发现，当接种率为1∶1时，泡菜的味道最好。当两种菌株混合接种时，发酵速度加快，乳酸菌产生乳酸的速度增加，pH值加快，泡菜产品香气浓郁，口感好。苗钟化[12]对比了泡菜直投菌同鼠李糖乳杆菌GG对因抗生素导致的小鼠肠胃紊乱的效果，发现两种条件下制作的泡菜均有改善的效果。任大勇等[13]发现植物乳杆菌对辣白菜泡菜中风味物质的生成及菌群结构有着明显的影响，其能够导致菌落丰度降低，总酸含量在第5天达到最高，但总体上可以缩短发酵时间。而本试验使用的两种菌均为前人实验得到较好的发酵效果，如李霜等[14]从市售泡菜中分离到一株可以降解亚硝酸盐的植物乳杆菌SA-4(LactobacillusplantarumSA-4)，其采用该菌株发酵泡菜可以显著降低泡菜基质中的亚硝酸盐。凌洁玉等[15]也通过实验证实了植物乳杆菌具有降解亚硝酸盐的作用，因此说明该属菌株可以作为发酵泡菜的一种直投菌株。

3.3 接种量对泡菜接种和发酵的影响

在本小节试验中采用鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌为1∶1的比例，在接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%的情况下，分别考察成品甘蓝泡菜的颜色、香气、味道、质地情况，对其进行评分(见表3)，同时以发酵泡菜基质中的总酸和pH为指标，测定了在不同接种量的情况下两种指标发生的变化。

表3 泡菜的不同接种量的综合评分表Table 3 Comprehensive scoring table of pickle with different inoculum size

图3 不同接种量对总酸和pH的影响Fig.3 Effect of different inoculum size on total acid and pH

由图3可知，接种量对泡菜的质量有很大影响。较小的接种量导致较长的发酵时间，造成发酵基质出现较低总酸和较高pH的情况，影响产品生产率和发酵周期。当接种量过大时，乳酸菌的生长速度过快，会增加产品乳酸，导致总酸过高，pH值过低，滋味较差，其他次生代谢废物的产量也增加。在该试验中，进行了接种量为1%、2%、3%、4%和5%的泡菜产品的感官评价。综合分析表明，当接种量为3%时，发酵得到的泡菜质量最好。

3.4 温度对泡菜发酵的影响

在本小节试验中采用鼠李糖乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1的比例，在接种量为3%的情况下，分别考察培养温度为23，30，37 ℃时成品甘蓝泡菜的颜色、香气、味道、质地情况，对其进行评分，同时以发酵泡菜基质中的总酸和pH为指标，测定了在不同温度情况下两种指标发生的变化。

表4 不同温度影响泡菜指标的综合评分表Table 4 Comprehensive scoring table of pickle indexes affected by different temperatures

由表4可知，泡菜的口感随着温度的升高而逐渐增加，并且在约30 ℃时获得最佳口感，当采用37 ℃发酵时品质会降低，说明温度是影响泡菜发酵的因素之一。这可能是因为当温度太低时，乳酸菌的生长速度变慢，泡菜的发酵周期大大增加，同时发酵的泡菜味道不好，质地柔软。当温度太高时，乳酸菌的生理活性受到抑制，泡菜颜色被发酵，甚至会有褐变发生。在本小节试验中，在23，30，37 ℃的温度下对泡菜产品进行感官评价后，发现发酵温度控制在约30 ℃时，泡菜的风味良好并且没有发生褐变。熊涛[16]在不同温度下以圆白菜为原料考察了发酵过程中发酵基质的pH、微生物等的变化，结果表明温度越高，发酵基质的pH越低，而当使用较低的培养温度发酵时，发酵的周期也变长。

3.5 蔗糖添加是泡菜发酵的影响

在本小节试验中采用鼠李糖乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1的比例，在接种量为3%，发酵温度为30 ℃的情况下，分别考察蔗糖添加量为0%、1%、2%、3%、4%时成品甘蓝泡菜的颜色、香气、味道、质地情况，对其进行评分(见表5)，同时以发酵泡菜基质中的总酸和pH为指标，测定了在不同温度的情况下两种指标发生的变化。

表5 不同加糖量泡菜质量的综合评分表Table 5 Comprehensive scoring table of pickle quality with different sugar additive amount

图4 不同蔗糖添加量对总酸和pH的影响Fig.4 Effect of different sucrose additive amount on total acids and pH

由图4可知，总酸含量随着蔗糖含量的增加而增加，pH值随着蔗糖含量的增加而降低。当蔗糖含量增加时，乳酸菌发酵的乳酸含量也增加，因此pH值降低并且总酸含量增加。当加入的糖量为2%时，颜色鲜艳，味道更好，存在典型的泡菜风味，并且气味强烈。如果不添加蔗糖，则发酵的泡菜产品不具有良好的口感，并且香气不浓，pH太高且总酸太低。加入蔗糖后，泡菜的质量不会受到影响，但当蔗糖含量过高时，过多的糖会降低泡菜的酸度，同时增加成本，此时pH较低，味道极佳。因此，根据感官、总酸和pH值的结果分析后得出结论，当加入的蔗糖量为2%时产品最佳。

燕平梅等[17]通过实验研究了蔗糖对发酵蔬菜品质的影响，其发现在2%浓度下制作的泡菜产品中亚硝酸盐含量最低，乳酸菌的含量最高，该实验结果同本小节试验的结果相同，可以推测在一定条件下，添加2%的蔗糖有利于减少泡菜中的亚硝酸盐含量，同时还能够提高蔬菜的脆度和口感以及翠绿的外观颜色。侯方丽等[18]也使用甘蓝作为主要原料考察了不同因素对甘蓝泡菜品质的影响，发现当蔗糖添加量为2%时，发酵6 d后亚硝酸盐含量降低到符合国家标准水平，该结果同本试验的研究结果相同。

3.6 盐添加量对泡菜发酵的影响

在本小节试验中采用鼠李糖乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1的比例，在接种量为3%、发酵温度30 ℃的情况下，分别考察在食盐添加量为2%、3%、4%、5%、6%的情况下对成品甘蓝泡菜的颜色、香气、味道、质地情况，对其进行评分(见表6)，同时以发酵泡菜基质中的总酸和pH为指标，测定了在不同食盐添加量的情况下两种指标发生的变化。

图5 不同盐添加量对总酸和pH的影响Fig.5 Effect of different salt additive amount on total acids and pH

在本小节试验中，当泡菜盐的添加量为2%、3%、4%、5%、6%时，通过综合评分评价泡菜产品，并测定总酸和pH。由图5可知，随着盐浓度增加，pH值增加，总酸减少。当盐浓度为2%时，pH值太低，总酸含量高，成品泡菜的味道太酸，但加入不同食盐含量发酵的泡菜在感官上差别不大。当盐含量为3%时，泡菜味道最好，味道鲜脆，香气浓郁，质地不柔软，但在此盐浓度下，pH值也低，总酸度过高，不利于泡菜的贮藏，保鲜期短，容易腐败，从保质期和货架期方面来看，应选择较高的盐浓度，如4%。但当盐的浓度太高时，味道过咸，颜色不新鲜，呈现黑黄的状态，并且随着盐浓度增加，pH降低的速率将变慢。此外，盐浓度过高不利于身体健康。因此，盐的最佳加入量为4%。

表6 不同加盐量泡菜质量的综合评分表Table 6 Comprehensive scoring table of pickle quality with different salt additive amount

王向阳等[19]以萝卜为主要原料研究了腌制条件对加工工艺和保质期的影响，结果表明：在4%的食盐添加量时，适合乳酸菌的生长及生成适量的乳酸，而且还能减少引起生花等腐败菌的繁殖，其也验证了在泡菜基质中接种植物乳杆菌可以将发酵时间控制在适当的范围，而且成品的腌萝卜泡菜口感和风味最好。李军波[20]通过多项指标考察了食盐浓度对发酵型泡菜的影响，发现在2%的食盐添加量时，泡菜中的乳酸菌菌体数量最高，但是发酵泡菜基质中的pH很低；而5%食盐添加量可以较好地抑制其他腐败菌的繁殖。该试验结果同本小节试验得出的采用4%的食盐添加量的结论相似。付莎莉等通过试验研究了不同食盐浓度对白菜、豇豆、萝卜3种不同蔬菜发酵制备泡菜的影响，结果表明：在食盐添加量为6%时，革兰氏阳性菌占据主要菌群优势，其中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是发酵中的有益菌。该结果与本小节试验结论比较接近，在以蔬菜为发酵原料时，食盐的最佳添加量约为4%～6%，而且为了保证发酵泡菜能够含有较低的杂菌数量，在此范围内适合植物乳杆菌生长。

3.7 接种量对泡菜亚硝酸盐含量的影响

在1∶1比例接种量的条件下对泡菜基质亚硝酸盐含量的影响见图6。不同的接种水平对泡菜的亚硝酸盐含量有一定的影响。随着接种量的增加，亚硝酸盐含量降低。原因可能是接种乳酸菌后会产生大量的乳酸，这会使亚硝酸盐还原为无毒物质，也可能是因为接种了大量的乳酸菌，抑制了其他细菌的生长，并减少了硝酸盐还原成亚硝酸盐的量。但当接种量过大时，泡菜的味道会变酸，综合考虑，当接种量为3%时，亚硝酸盐含量低，口感最佳。

图6 不同接种量对泡菜中亚硝酸盐含量的影响Fig.6 Effect of different inoculum size on nitrite content in pickle

3.8 温度对泡菜亚硝酸盐含量的影响

温度对泡菜中亚硝酸盐含量的影响不是很大，但是当温度高时，乳酸菌的生长受到抑制，并且大大降低了亚硝酸盐的还原能力，导致亚硝酸含量增加。当温度低时，乳酸菌的活性将受到一定程度的抑制。只有当乳酸菌处于最佳温度时，才适合发酵泡菜，试验结果见表7。综合考虑，采用30 ℃的发酵温度制作甘蓝泡菜较为适合。

表7 温度对泡菜亚硝酸盐含量的影响Table 7 Effect of temperature on nitrite content in pickle

3.9 不同菌株对泡菜亚硝酸盐含量的影响

对泡菜的制作影响因素最大的是微生物的作用，本试验采用接种不同比例的鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌进行发酵甘蓝泡菜的试验，试验结果见表8。

表8 不同菌株对泡菜中亚硝酸盐含量的影响Table 8 Effect of different strains on nitrite content in pickle

当采用鼠李糖乳杆菌单独接种时，泡菜的亚硝酸盐含量较低，此时泡菜的味道不太好；当单独接种植物乳杆菌时，泡菜的味道变得更好，但亚硝酸盐含量更高；当两种菌株组合使用时，泡菜的亚硝酸盐含量较低，而且还具有良好的口感，因此采用1∶1的比例接种于甘蓝泡菜进行发酵结果最好。

李春等[21]证实鼠李糖乳杆菌在一定条件下可以降解亚硝酸盐，该试验结果同本试验结果一致，而且鼠李糖乳杆菌可以抑制黄曲霉等产毒真菌，具有较强的抑制作用[22]。植物乳杆菌具有较强的降解亚硝酸盐的作用[23]，杨晶等[24]还通过实验证实其降解亚硝酸盐与其产酸能力有关，其中苹果酸和乳酸的效果最明显。

4 结论

通过单因素试验确定了接种乳酸菌发酵甘蓝泡菜的最佳工艺条件：4%食盐，3%乳酸菌接种量(30 ℃发酵温度，2%蔗糖，植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌比例为1∶1)。采用人工接种和发酵的泡菜具有更好的味道，并且亚硝酸盐含量远低于标准的20 mg/kg泡菜产品标准。而且接种发酵比自然发酵时间短，可以实现批量化生产，所得产品具有相似的稠度，远优于自然发酵的泡菜口感和质量。