脉冲染料激光联合二氧化碳点阵激光对兔耳增生性瘢痕的影响

彭 曦 熊 维 黄海艳 邹彦芬 姜 彬 刘小明 简杏玲 于 波

北京大学深圳医院皮肤科，深圳，518000

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，在白种人群中增生性瘢痕的发病率在5%～37%，在黑色人种中的发生率是白种人的5～15倍，而肤色较浅的亚洲人种发病率介于两者之间[1]。其中，增生性瘢痕在临床上表现为不超过伤口范围的高出皮表面的瘢痕组织，好发于女性，早期充血明显，伴瘙痒或疼痛等感觉，位于关节部位则可能会引起活动功能障碍，具有浸润生长，易复发等一些类似肿瘤的特性，因此近年来被列为良性肿瘤的范围[2]。目前瘢痕的发病机制不明确、治疗手段多样但效果均很有限，是皮肤科及整形科的难题之一[3]。目前常用的激光设备，如PDL的靶色基为血红蛋白，选择性加热血红蛋白，破坏血管内皮细胞，起到封闭血管的作用，CO2FL的靶色基为皮肤组织中的水分，加热后刺激胶原纤维的增生与重塑。这两种激光被多个临床研究证实对增生性瘢痕的预防及治疗均有效，有临床研究[4，5]应用两者联合治疗，证实有效，也有相应的动物实验研究两者联合治疗的效果及探讨其机制[6]。本研究拟在兔耳动物模型上，比较两种激光设备对增生性瘢痕的预防及治疗作用，以明确联合治疗效果是否优于单种激光治疗，以及早期干预对于增生性瘢痕的预防及治疗是否重要。

1 材料与方法

1.1 兔耳瘢痕造模与分组 参考Morris等[7]报道的方法，构建兔耳增生性瘢痕模型，简单叙述如下：选取20只雌性新西兰大耳白兔，体重在2.5 kg左右，采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后，在兔双耳腹侧各做8处直径为1 cm的全层皮肤及软骨膜缺损切口，切口之间间距1 cm以上，每只兔耳选取造模成功6处切口进行后续实验，共计选取240个切口。术后待创面自然愈合，正常饲养。待术后2周，所有创面愈合(即上皮化)后，随机选取10只入上皮化实验；剩余10只待术后4周瘢痕形成，入瘢痕实验。上皮化实验分为CON-1(对照组-1)、PDL-1组、CO2FL -1组和PDL+CO2FL-1(联合组-1)；瘢痕实验分为CON-2(对照组-2)、PDL-2组、CO2FL-2组和PDL+CO2FL-2(联合组-2)。见图1、2。

1.2 治疗方案与取材 在上皮实验和瘢痕实验中：CON组不做任何治疗干预；PDL组接受PDL激光(585 nm)治疗，共2次，间隔2周，参数为能量5.5～8.5 J/cm2、脉宽0.5～2 ms、频率1 Hz、光斑7 mm；CO2FL组接受CO2FL激光(10 600 nm)治疗，共2次，间隔2周，参数为微脉冲60 mJ、密度5%、重复2～6次、光斑可调；联合组在单次治疗中先予以PDL治疗，后即刻予以CO2FL治疗(共2次，间隔2周，PDL和CO2FL的参数设置同上。考虑到兔耳不同部位的瘢痕有可能会对治疗效果造成影响(例如兔耳边缘及中央)，因此治疗过程中每侧兔耳随机选择不同的部位进行不同的激光治疗。

关于取材方案，在上皮化实验中，在上皮化后干预治疗前(0天)和上皮化后2周(14天)、4周(28天)分别切取4组的增生性瘢痕，共计取材120处，用于组织学、RNA分析。瘢痕实验取材方案与上皮化实验相同。

1.3 观察指标 具体观察指标包括：①瘢痕增生指数(scar elevation index，SEI)：即SEI=(瘢痕厚度-正常兔耳厚度)/正常兔耳厚度；当SEI>1.6，认为存在明显瘢痕，提示瘢痕增生模型成功。②瘢痕内成纤维细胞密度：采用HE染色法对瘢痕进行细胞学分析，按照HE染色试剂盒(武汉谷歌生物科技公司，G1005)步骤操作。在普通光学显微镜下观察瘢痕块的组织结构和成纤维分布，计算成纤维细胞密度，具体方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件计算出视野内成纤维细胞数目，求出与视野面积的比值，并算出5个视野的平均成纤维细胞密度值。③胶原纤维面积百分比：采用Masson染色法对瘢痕进行胶原纤维形成情况分析，按照Masson染色试剂盒(Servicebio，G1006)步骤操作。在普通光学显微镜下观察瘢痕块的胶原纤维形成和分布，计算胶原纤维面积百分比，具体方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件计算出视野内蓝染的胶原纤维面积，求出该面积与组织总面积的比值，即胶原纤维面积百分比，并算出5个视野的平均胶原纤维面积百分比。④细胞凋亡率：采用TUNEL法评估瘢痕组织内细胞凋亡情况，按照TUNEL染色试剂盒(罗氏，11684817910)步骤操作。凋亡细胞的细胞核呈现淡棕色至深棕黄色颗粒。高倍镜下，每张切片随机选取3个阳性细胞最多的视野进行计数，计算凋亡细胞率(凋亡细胞数/总细胞数)，取3个视野的均数。⑤TGF-β1、Smad3基因的mRNA表达水平：提取瘢痕组织内的总RNA，采用RT-PCR方法，进行40个循环扩增， GAPDH为内参基因，采用靶基因量=2-δδCt公式计算TGF-β1、Smad3基因mRNA水平，采用比较Ct值方法以内参相对定量靶基因表达水平。引物设计如下：TGF-β1:(F)5’-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3’，(R)5’-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3’；Smad3:(F)5’-CAGCGACCACCAGATGAAC-3’,(R)5’-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’；GAPDH:(F)5’-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3’,(R)5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 兔耳瘢痕增生指数变化情况 在上皮化实验部分，与对照组相比，联合组术后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均显著下降，此外分别与PDL组和CO2FL组相比，联合组的SEI均较相同时间点显著下降(P<0.05)。结果提示联合组较单独处理治疗更能有效预防上皮化后创面瘢痕增生。见表1、图1。在瘢痕实验部分，与对照组相比，联合组术后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均显著下降；分别与PDL组和CO2FL组相比，联合组的SEI均较相同时间点显著下降(P<0.05)。结果提示联合PDL与CO2FL治疗较单独处理更能有效改善增生性瘢痕。见表1、图2。

表1 兔耳瘢痕增生指数变化情况

注：与联合组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 瘢痕内成纤维细胞密度及胶原纤维面积变化情况 鉴于治疗效果在28天可见显著差异，我们进一步关注治疗28天和治疗前的效果比较。在上皮化实验部分，与对照组相比，联合组术后28天瘢痕内成纤维细胞密度(P<0.05)和胶原纤维面积百分比(P<0.01)均显著下降，此外和CO2FL组相比，联合组术后28天瘢痕内成纤维密度(P<0.05)和胶原纤维面积百分比(P<0.05)均显著下降；而与PDL组相比未见明显差异。结果提示联合组较CO2FL处理治疗更能有效预防上皮化后创面瘢痕增生。在瘢痕实验部分，与对照组相比，联合组术后28天瘢痕内成纤维细胞密度(P<0.05)和胶原纤维面积百分比(P<0.05)均显著下降；与CO2FL组相比，联合组术后28天瘢痕内成纤维细胞密度(P<0.05)和胶原纤维面积百分比(P<0.05)均显著下降；而与PDL组相比未见明显差异。结果提示联合PDL与CO2FL治疗较CO2FL处理更能有效改善增生性瘢痕。见表2。

2.3 瘢痕内细胞凋亡检测结果 在上皮化实验部分，与对照组相比，联合组术后28天瘢痕内细胞凋亡率(P<0.01)显著上升，此外与CO2FL组或PDL组相比，联合组术后28天瘢痕内细胞凋亡率(P<0.05)显著上升；提示联合组较单独处理治疗更能有效促进上皮化后创面瘢痕内细胞凋亡。瘢痕实验的结果趋势与上皮化实验趋势相一致，结果提示联合PDL与CO2FL治疗较单独处理更能有效促进增生性瘢痕内细胞凋亡。见图3。

2.4 TGF-β1、Smad3的mRNA表达情况 在上皮化实验部分，与对照组相比，联合组术后28天瘢痕内TGF-β1和Smad3 mRNA水平(P<0.01)显著下降，此外和CO2FL组或PDL组相比，TGF-β1和Smad3 mRNA均未见明显差异；在瘢痕实验部分，与对照组相比，联合组术后28天瘢痕内TGF-β1 和Smad3 mRNA水平显著下降(P<0.01)，与CO2FL组相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降(P<0.05)，而与PDL组相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平未见明显差异。结果提示联合组治疗更有效抑制上皮化后及增生性瘢痕内TGF-β1和Smad3 mRNA水平上升。见图4、5。

图1 上皮化后创面瘢痕增生治疗情况 1a、1b：上皮化创面;1c、1d:接受治疗第14、28天 注：C为CO2FL，P为PDL，P+C为联合组，(-)为对照组 图2 增生性瘢痕治疗情况 2a、2b：增生性瘢痕;2c、2d：接受治疗第14、28天 注：C为CO2FL，P为PDL，P+C为联合组，(-)为对照组

表2 兔耳瘢痕内成纤维细胞密度指标和胶原纤维面积百分比变化情况

注：*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

增生性瘢痕的发病机制尚不完全清楚，治疗效果有限，是研究的热点与难点之一。其治疗方法多种多样，主要有：药物治疗、压迫治疗、放射治疗、硅胶薄膜、生物治疗、激光治疗、基因治疗等[4-8]。随着激光技术的发展，多种激光设备被用于治疗增生性瘢痕。目前已有动物实验及临床研究证实激光对增生性瘢痕有治疗作用[9-11]。根据治疗时期的不同可将其分成：前期以抑制瘢痕的血管增生为主；后期以抑制瘢痕的成纤维细胞增生，促进细胞凋亡为主；成熟期以削平凸起的瘢痕组织，促进胶原再生与表皮重建为主。由于激光设备和波长的不同,其作用机制可能不是单方面的,而是多种机制共同作用来治疗瘢痕。针对血管治疗的激光有：脉冲染料激光(PDL)585 nm、595 nm，Versa Pulse可调脉宽倍频Nd:YAG532 nm，强脉冲光(IPL)等[12-14]。刺激胶原再生与组织重塑的代表性激光有2940 nm Er:YAG点阵激光、点阵CO2激光等[15]。

针对兔耳增生性瘢痕模型的研究：Kuo等[16]研究证实脉冲染料激光(PDL)可减少 TGF-β的表达，从而抑制成纤维细胞的增殖与分裂，减少胶原沉积。朱玉等[17]验证不同治疗周期PDL照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的增殖过程，诱导细胞凋亡，且1周治疗组与2周治疗组两组无明显差异。王家亮等[18]发现2940 nm点阵铒激光能有效改善兔耳增生性瘢痕的厚度，降低瘢痕组织中VEGF的表达，从而达到治疗目的，猜测2940 nm点阵铒激光治疗机制与改善瘢痕内血管与胶原的增生有关。谭军等[19]证实点阵CO2激光治疗兔耳增生性瘢痕使瘢痕软化、完全平坦所需时间缩短、成纤维细胞数量明显减少、胶原排列有序，成纤维细胞凋亡较对照组明显增高，同时降低VEGF的表达，促进瘢痕的成熟与萎缩，达到治疗的目的。李军[6]通过比较治疗前后瘢痕增生指数,免疫组织化学SP法检测瘢痕组织中胶原蛋白I、III的水平，证实CO2点阵激光和595 nm脉冲染料激光联合治疗，有利于兔耳增生性瘢痕的治疗,其机制与抑制胶原蛋白合成和改善胶原结构有关。

本研究通过对兔耳瘢痕进行激光治疗后，进行病理切片HE染色观察瘢痕增生指数及瘢痕内成纤维细胞密度，Masson染色观察胶原纤维面积百分比，TUNEL法检测瘢痕内细胞凋亡率，RT-PCR检测TGF-β1、Smad3的mRNA表达，明确了PDL和CO2FL对增生性瘢痕的预防及治疗均有效，且两者联合运用效果更好。在上皮化实验及瘢痕实验中，联合治疗组与未治疗的对照组相比，均显示有效；联合治疗组与PDL组、CO2FL组对比，多数显示更有效。但在上皮化实验及瘢痕实验中，联合组与PDL组的瘢痕内成纤维细胞密度及胶原纤维面积百分比，相比无显著差异；联合组与PDL组的TGF-β1、Smad3的表达无显著差异。上皮化实验的TGF-β1、Smad3的表达与CO2FL组无显著差异。说明联合治疗有效，单一的PDL或CO2FL也有效果，但相对而言，联合治疗效果更佳。通过实验发现，激光治疗后TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降，成纤维细胞凋亡增多，瘢痕内成纤维细胞及胶原纤维减少，因此可以推测激光治疗通过下调TGF-β1-Smad3途径促使成纤维细胞凋亡而抑制血管内皮细胞的增生，使胶原纤维的代谢恢复正常，促使瘢痕萎缩变平，从而达到治疗效果。但实验由于数据过多，未将上皮实验与瘢痕实验的数据做对比，因此很难得出提前干预瘢痕是否会有更好效果的结论。