基于含量测定与药效活性相结合的川楝子质量评价

苏杭，薛倩倩，费程浩，李伟东，殷放宙

(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

川楝子是楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果实，表面金黄色至棕黄色，微有光泽，别名金铃子、川楝实、楝实等，是我国沿用已久的理气药和驱虫药。其主要产于四川、贵州、湖南、湖北等地，尤以四川的川楝子质量最为上乘。川楝子性寒味苦且有小毒，归肝、小肠、膀胱经，擅于疏肝泻热、行气止痛及杀虫，用于胸胁、脘腹胀痛，疝气疼痛及虫积腹痛等证[1]。现代医学研究表明川楝子具有驱虫、抗菌、抗炎、抗癌、利胆、抗乳腺增生等功效[2-7]。川楝子主要化学成分为三萜类化合物如川楝素(Toosendanin)，其次是紫罗兰酮型倍半萜的糖苷类化合物。此外，川楝子中尚含有挥发油、黄酮、脂肪酸、酚酸和多糖等化合物[8-9]。目前认为川楝素是川楝子的主要药效物质基础及毒性成分[10]，其具有驱虫、抗癌、抗菌等多种生物活性。2015版《中国药典》将川楝素作为评价川楝子质量的唯一指标。异川楝素(Isotoosendanin)是川楝素的同分异构体，具有与川楝素类似的作用，但其毒性远较川楝素高，故评价川楝子质量时也需考虑其含量。现代研究表明川楝子具有显著的抗肿瘤活性，拓展了川楝子的临床应用价值。但川楝素对肿瘤细胞的选择性不强，其抑制肿瘤生长的剂量对正常细胞也具有细胞毒性作用，因此，降低川楝素使用剂量，使其能增强肿瘤细胞对靶向抗肿瘤药物的敏感性是值得深入研究的方向。TRAIL是临床研究上极具开发前景的靶向抗肿瘤蛋白质药物，在多个国家进入临床研究，它能选择性诱导肿瘤细胞死亡，而对正常细胞的毒性较小，对多种肿瘤具有明显的抑制效果，甚至能完全清除某些特定肿瘤类型。但非小细胞肺癌对其敏感性较低，其主要原因在于非小细胞肺癌细胞膜缺乏TRAIL受体的表达。因此，通过低剂量中药小分子化合物选择性诱导非小细胞肺癌细胞膜TRAIL受体表达，逆转非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性，增强TRAIL对非小细胞肺癌治疗效果，发挥中西药结合增效、精准治疗肿瘤的优势。课题组前期研究结果表明川楝素能显著增强非小细胞肺癌细胞膜TRAIL受体表达[11]，进而显著逆转非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性。而前期实验室关于川楝素药效的研究发现其对于增加抗癌药物的敏感性有较强的作用。为实现从内在物质及其细胞活性两方面评价川楝子的质量，本文针对这2种成分采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(UHPLC-QqQ-MS/MS)测定了川楝子中川楝素及异川楝素的含量，并利用分光测色仪量化川楝子的颜色，同时采用流式细胞仪检测川楝子提取物对TRAIL诱导的非小细胞肺癌细胞A549凋亡的增效作用，以及对非小细胞肺癌细胞膜死亡受体DR5表达的影响，以期为川楝子的质量控制提供借鉴。

1 材料

AB SCIEX Triple Quad 5500质谱仪配Analyst工作站(美国AB Sciex公司)，LC-30A超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，CM-5型分光测色仪(日本柯尼卡美能达有限公司)，Milli-Q3超纯水处理系统(美国Millipore公司)，SQP型电子天平(德国Sartorius公司)，KQ-500E型超声仪(昆山市科导超声仪器有限公司)，MicroCL 17台式高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)，FACS Calibur及BD Accuri流式细胞仪(美国BD公司)。

10批川楝子样品分别采自四川、河北等地，经南京中医药大学李伟东教授鉴定为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 川楝素及异川楝素的含量测定[12-13]

2.1.1 对照品溶液制备 精确称取川楝素及异川楝素对照品，分别用甲醇溶解并配制成含川楝素0.394 mg/mL，异川楝素0.440 mg/mL的对照品母液。分别精密吸取各对照品母液适量至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含川楝素41.505 μg/mL，异川楝素0.488 μg/mL的混合对照品溶液，并通过甲醇进一步稀释制备成6种不同浓度水平的标准溶液，用于评估线性。

2.1.2 供试品溶液制备 取川楝子样品粉末(过4号筛)0.1 g，精密称定，置于10 mL容量瓶，加甲醇超声提取30 min(功率250 W，频率20 kHz)，取出，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心5 min，转速为12 000 r/min，取上清液进样分析。

2.1.3 色谱及质谱条件 色谱条件：Poroshell 120 SB C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～1 min，10%～30%B；1～3.5 min，30%～40%B；3.5～6.5 min，40%～75%B；6.5～7 min，75%～95%B；7～7.5 min，95%B)，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量为1 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式，离子喷雾电压-4 500 V，涡轮喷雾温度550 ℃，喷雾器气压55 psi，加热器气压55 psi，碰撞气压中等，气帘气压35 psi，1 psi=6.895 kPa，接口加热器打开，采用多反应检测模式(MRM)监测。川楝素及异川楝素质谱分析条件参数见表1。

表1 川楝素、异川楝素质谱分析条件参数

2.1.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品，注入UHPLC-QqQ-MS/MS系统，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归，川楝素及异川楝素的线性方程分别为：Y=8 979.74X+86 723.90，r=0.999 1；Y=1 923.97X-2 090.14，r=0.999 6。川楝素及异川楝素分别在259.4～5 188.2，3.1～61.0 ng/mL范围内呈良好线性关系。

2.1.5 方法学考察 精密吸取川楝子供试品溶液，连续进样6次，测得川楝素、异川楝素平均峰面积分别为19 194 583.33、62 593.23，RSD分别为2.79%、1.96%，表明仪器精密度良好。

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精密吸取川楝子供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测得川楝素、异川楝素的平均峰面积分别为18 972 039.16、62 532.29，RSD分别为2.32%、1.22%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

分别取6份川楝子粉末0.1 g，精密称定，制备供试品溶液并进样分析，测得川楝素、异川楝素的平均含量分别为1.024、0.017 mg/g，RSD分别为2.43%、1.68%，表明该方法重复性良好。

取已知含量的同一批川楝子粉末各5份，每份0.05 g，精密称定，准确加入与样品中含量等量的川楝素及异川楝素对照品，制备供试品溶液并进样分析，川楝素及异川楝素的平均加样回收率分别为102.3%、101.4%，RSD分别为2.28%、2.23%。

2.1.6 样品含量测定 取各批川楝子粉末(过4号筛)0.1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项条件下进样，计算含量，每批样品平行测定3次。由于川楝素和异川楝素结构中具有半缩醛结构，始终有2个互变异构体存在，在色谱图中显示2个色谱峰，故以其各自2个峰面积之和定量代入线性回归方程，计算含量。具体结果见图1、表2。

2.2 颜色检测

2.2.1 检测条件 光源为脉冲氙灯，光源标准观察角度8°，测量口径∮30 mm，测量波长范围为360～740 nm，重复性标准偏差△E*ab在0.07以内，采用SCI反射光模式进行测定[14]。

川楝子样品粉碎(过4号筛)，各取2 g放入检测皿中，重复测定色度3次，以均数为最终测定结果。

2.2.2 方法学考察 取同一批次川楝子样品粉碎后进行测色方法的相应考察。连续采集同一份样品的颜色值6次，测得L*、a*、b*的平均值分别为68.89、5.93、27.00，RSD分别为0.01%、0.13%、0.07%，表明该方法精密度良好。

取同一份川楝子样品分别于0、2、6、8、10、12、18、24、36、48 h进行颜色检测，测得L*、a*、b*的平均值分别为69.37、5.96、26.97，RSD分别为0.33%、0.49%、0.15%，表明样品在48 h内检测结果稳定。

取6份川楝子样品分别置于检测皿中，进行颜色检测，测得L*、a*、b*的平均值分别为69.67、5.94、26.94，RSD分别为0.19%、0.58%、0.22%，表明该方法重复性良好。

2.2.3 样品检测 分别取10批川楝子样品粉碎后进行颜色检测，结果见表2。

表2 10批川楝子样品的含量及颜色测定结果

2.3 川楝子对TRAIL诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡的影响

2.3.1 供试品制备 取不同产地川楝子饮片10 g，粉碎(过4号筛)，加入乙醇回流提取3次，合并提取液，挥去乙醇，将浸膏冷冻干燥，加入100 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，滤去不溶物，将澄清透明含药DMSO溶液按1∶1 000(合生药量0.1 mg/mL)加入细胞培养液中，100 nmol/L川楝素标准溶液作为阳性对照。

2.3.2 细胞培养与药物处理 将非小细胞肺癌细胞A549接种于12孔板，待细胞生长至融合度75%左右，加入TRAIL(10 nmol/L)与不同批次川楝子提取液处理24 h，收集细胞，进行流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.3.3 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 采用Annexin V/PI双染法检测A549细胞凋亡。将12孔板细胞用PBS清洗，加入胰酶消化，细胞培养液终止消化，离心，弃上清，用Binding buffer清洗细胞，再次离心，用含有AnnexinV-FITC的Binding buffer重悬细胞，冰上暗处孵育15 min，加入碘化丙啶(PI)，通过流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。

2.3.4 细胞凋亡结果 结果见图2，单用TRAIL组非小细胞肺癌细胞A549凋亡不明显，表明A549细胞对TRAIL相对耐受，阳性对照药川楝素能显著增强A549细胞对TRAIL的凋亡敏感性。基于此，发现不同批次的川楝子提取物均能显著增强A549细胞对TRAIL的凋亡敏感性，但增敏程度有差异。

2.4 流式细胞仪测定非小细胞肺癌细胞膜死亡受体的表达

2.4.1 细胞处理 将A549细胞接种于12孔板中，待细胞汇合度达到75%左右时，加入不同产地川楝子提取物处理细胞12 h，处理后胰酶消化收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞，5%的BSA冰上封闭细胞30 min，PBS洗涤，弃上清。加入DR5一抗，并与细胞一起于冰上孵育2 h，离心，加入FITC荧光标记二抗，冰上孵育1 h后离心，弃上清。将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，流式细胞仪FL1通道检测细胞膜DR5表达。

2.4.2 结果 结果见图3，A549细胞膜(对照组)表面TRAIL受体DR5表达较低，这是A549细胞对TRAIL诱导细胞凋亡不敏感的重要原因，阳性对照药川楝素能显著增强细胞膜DR5表达(52.3%)。不同产地来源的川楝子提取物均能不同程度地刺激A549细胞膜DR5受体表达。

3 讨论

本实验采用UHPLC-QqQ- MS/MS质谱扫描确定了川楝素的特征离子对m/z573→531和m/z573→425，异川楝素的特征离子对m/z573→513和m/z573→531，并优选响应强度较高的离子对进行定量分析。本方法稳定性好、灵敏度高、分析时间短，能快速、准确地对川楝子中川楝素、异川楝素进行含量测定。同时采用CIE L*a*b*颜色空间实现了对川楝子的颜色值量化。本研究发现不同批次的川楝子提取物均能显著增强A549细胞对TRAIL的凋亡敏感性与TRAIL受体DR5的表达，该有效成分与药效活性相结合实验结果表明，川楝素与异川楝素含量能有效地用于评价川楝子饮片质量。

药效活性结果发现来自河北、安徽、云南及四川(2，6)川楝子样品在增强A549细胞对TRAIL的凋亡敏感性及刺激A549细胞膜DR5受体表达作用较强，此结果与饮片内在特征成分川楝素、异川楝素含量基本一致。但由于川楝素是川楝子的毒性成分之一，2015版《中国药典》规定其含量应控制在0.04%～0.20%，药效作用较强的几批样品含量均已超出目前规定的上限，剩余的4批四川(1，3～5)样品符合药典规定。来自河北、安徽、云南及四川(2，6)川楝子样品虽不符合药典规定，但由于川楝素与异川楝素含量较高，在提取分离川楝素等活性成分方面具有较好的应用价值。此外，与异川楝素相比较，川楝素的含量在决定川楝子增效TRAIL抗非小细胞肺癌中发挥更重要作用。因此，评价中药饮片质量一定要结合具体的药效与功能主治，根据其治疗用途选择合适的有效成分，制定相应质量标准。

川楝子成分复杂，不能以单个成分含量判断产品的整体质量，后期拟采用多成分同时测定的方式建立更全面的评价方式；另外，川楝子有小毒，常炮制后用药，后期可以进一步研究川楝子不同炮制品颜色及成分含量的变化，全面地说明炮制对样品的影响，为中药川楝子的质量控制提供实验依据。