湖州地区渔用饲料中四环素类药物残留分析

徐磊　盛鹏程　屠仁千　孙博怿

摘要    为了解湖州地区渔用饲料中抗生素的污染水平，利用超高效液相色谱-串联质谱仪，对湖州地区渔用饲料中的土霉素、金霉素、四环素和强力霉素开展了检测分析。结果表明，饲料中四环素类抗生素的加标回收率很低，需要用基质加标的方法去定量才能保证回收率以满足试验要求。在18份饲料样品中，共有8份饲料样品中测出1～3种四环素类抗生素，检出率为44.4%;其中金霉素的检测率最高，为33.3%。不同养殖品种所用的饲料中四环素类抗生素含量存在差异，这一方面与养殖模式有关，另一方面也与养殖场的管理混乱有关。

关键词    渔用饲料;四环素类抗生素;回收率;污染水平;浙江湖州

中图分类号    S816.7        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）09-0217-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In order to understand the pollution level of antibiotics in fishery feed in Huzhou area，the detection and analysis of oxytetracycline，chlortetracycline，tetracycline and doxycycline in fishery feed in Huzhou area were carried out by using ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry.The results showed that the recovery rate of tetracycline antibiotics was very low，and it needs to be quantified by matrix addition to ensure that the recovery rate can meet the experimental requirements.Among the 18 feed samples，1-3 kinds of tetracycline antibiotics were detected in 8 feed samples，the detection rate was 44.4%，among which the detection rate of chlortetracycline was the highest（33.3%）.The content of tetracycline antibiotics in the feed of different breed was different.On the one hand，it was related to the breeding mode;on the other hand，it was also related to the management confusion of the farm.

Key words    fishery feed;tetracycline antibiotic;recovery rate;pollution level;Huzhou Zhejiang

抗生素是生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动过程中所产生的（或由其他方法获得的）有机代谢产物，能在低微浓度下选择性地抑制或影响其他生物的次级代谢产物及其衍生物[1]。其中，四环素类抗生素（tetracyclines，TCs）是由链霉菌产生的一类广谱抗生素[2]，包括金霉素（chlortet-racycline）、土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。作为目前我国生产和使用最广泛的抗生素之一，四环素类抗生素被广泛地运用于水产养殖过程中，其中一种方法便是将抗生素添加到饲料中。

饲料中大量添加四环素类抗生素会导致药物在生物体内的残留以及抗药菌株的产生[3-5]，目前许多国家对饲料中添加四环素类进行了严格的监控[6-7]。我国在2018年4月，由农业农村部印发《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018—2021年）》，力争通过3年时间，实施养殖环节兽用抗菌药使用减量化行动试点工作，而药物饲料添加剂计划将于2020年全部退出。

浙江湖州自古被誉为丝绸之府、鱼米之乡，是我国著名的十大淡水鱼养殖基地。渔业作为湖州农业的首位产业，2018年渔业总产值已突破100亿元，然而湖州地区渔用饲料中抗生素的残留情况研究目前仍是空白。本研究以湖州水产养殖中主要使用饲料为研究对象，建立一套方便快捷的四环素类检测方法，并对四环素类抗生素的污染水平进行初步分析，以了解飼料中四环素类抗生素的残留状况。

1    材料与方法

1.1    样品采集

采集时间为2017年4月，饲料来自于湖州地区的水产养殖场，采集点分布情况见表1，养殖品种主要选择的是湖州地区最主要的养殖品种，采样点主要分布于东、西苕溪周边以及南太湖沿岸（图1）。

1.2    仪器和材料

超高效液相色谱串联质谱仪（TQ MS/I-CLASS系列，美国Waters公司）;旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）;氮吹仪（美国Orgnomation公司）;冷冻干燥机（美国Labconco公司）;固相萃取装置（美国SUPELCO公司）。

盐酸土霉素（OTC）、盐酸金霉素（CTC）、盐酸四环素（TC）、盐酸强力霉素（DOX）均来自德国Dr. Ehrensorfer公司。

Oasis HLB 固相萃取小柱（225 mg/Oasis HLB Plus Short cartridges，美国Waters公司）。

SAX阴离子交换小柱（360 mg/Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Short Cartridge，美国Waters公司）。

1.3    样品处理

颗粒状的饲料研磨后过20目筛，准确称取2.00 g置于50 mL离心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液20 mL（每1 000 mL缓冲溶液中含柠檬酸水合物12.9 g、磷酸氢二钠10.9 g、Na2EDTA 37.2 g）。涡旋混匀1 min，摇床振荡20 min，超声波提取10 min，离心后收集上清液，残留物重复提取1次后，合并2次上清液，混匀后取20 mL过SAX-HLB串联小柱。上样前，SAX-HLB串联柱依次用5 mL甲醇、5 mL超纯水和5 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液活化平衡;上样时，将稀释水样流速控制在5～8 mL/min;上样后，将上层SAX柱取下后用10 mL超纯水淋洗 HLB 柱，负压抽干后置于冷冻干燥机中干燥10 min;最后用6 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液并在40 ℃下用氮气吹干，用流动相定容至1.0 mL。

2    结果与分析

2.1    质量控制

四环素类采用外标法进行定量分析。以空白饲料为基质进行加标试验，2.00 g饲料中分别加入10 ng和50 ng混合标准品，饲料中四环素类抗生素的回收率为23.5%～45.9%，其中土霉素的回收率最低、四环素回收率最高。回收率过低，无法满足试验要求。因此，本试验中的标准曲线采用空白饲料样品加标的方法制备，在2.00 g空白饲料中分别加入2、4、10、25、50、100 μL的混合标准储备液（1 000 μg/L），与样品同步处理。4种抗生素标准曲线R2在0.927 633～0.965 244之间，回收率为71.5%～129.4%（表2），满足试验要求。以S/N

≥3作为方法的最低检出限，饲料中四环素类抗生素的检出限为0.50～2.00 ng/g（图2）。

2.2    饲料样品中抗生素残留状况

在采集的18个饲料中，检测结果如表3所示，共有8个饲料样品检测出1～3种四环素类抗生素，检出率为44.4%。4种抗生素中CTC的检测率最高，为33.3%。其中，S5处青虾养殖场的饲料中检测出最高浓度，分别为CTC 2 580.00 ng/g、TC 546.00 ng/g、DOX 425.00 ng/g，远远高于其他7个饲料样品中测出的浓度。由于在水产养殖中四环素类抗生素主要用于防治鱼类的肠炎病、赤皮病等病害，如果人为在饲料中添加，一般添加量在10～100 mg/kg之间才会有治疗效果[8]。本研究中S5处饲料测得的四环素类浓度为0.425～2.580 mg/kg，遠低于一般的添加量，因而可以认为饲料中的抗生素并非是养殖户人为添加的。如果饲料中的抗生素并非是养殖户人为添加，那么渔用饲料中的抗生素来源一般有2种，一是饲料加工厂的人为添加，二是养殖户在养殖过程中因管理混乱所导致的污染。S5处饲料应该是属于第2种情况。虽然理论上要求在水产养殖过程中饲料与鱼药要分开存放，但在实际的操作过程中，这一点很容易被养殖户忽略，当饲料与鱼药同时存放在同一个储藏间内，难免会发生一些交叉污染，从而在饲料中检测出高浓度的抗生素残留。

2.3    不同水产养殖品种饲料中的抗生素残留分析

在9个水产养殖品种中，有6个品种的饲料检测出含有四环素类抗生素，其中泥鳅、青虾的4个饲料中抗生素检出率为100%。泥鳅作为一种高密度的养殖品种，属于无鳞鱼类，容易发生腐皮类的病害，四环素类抗生素在这方面有不错的效果。青虾作为湖州地区的特色产业，2018年的总产量占浙江省总产量的68%。由于青虾的养殖密度低，养殖模式也比较简单，很少发生病害，在养殖过程中一般不需要投放药物。S5和S6这2份饲料中检测出四环素类抗生素，S5是由于饲料被污染导致的，S6应该是在饲料的生产过程中加入的，至于原因，仍需要进一步调查。

从表4可以看出，外塘甲鱼饲料中含有的四环素类抗生素最多，另外有3个品种中未测出抗生素，分别是温室甲鱼、青鱼和乌鳢。有研究表明，在温室甲鱼的池塘水中可以检测出多组分、高浓度的抗生素，其中就包含有四环素类抗生素[8]。本研究中的2个温室甲鱼饲料样品中均未检测出四环素类抗生素，一方面是因为检测的饲料样品批次过少;另一方面可能是因为在温室甲鱼的养殖过程中，主要预防肺炎和出血病，一般用的比较多的药物是头孢类和氧氟沙星，四环素类抗生素并非是主要用药。青鱼的养殖周期比较长，一般养殖密度也不会很大，所以养殖过程中病害相对较少，对于药物的依赖性比较低。乌鳢是一个高密度的养殖品种，近些年以来，随着对渔业环境的越发重视，导致地方一直在推广投喂饲料的养殖模式，但这种模式却始终有弊端，在养殖后期乌鳢的畸形率明显高于投喂冰鲜的养殖模式。因此，有不少养殖户仍然在延用以前投喂冰鲜的养殖模式或者是混合投喂的养殖模式（前期投喂饲料，后期投喂鸡肝、鸭肝等冰鲜），所以乌鳢在养殖过程中对饲料的依赖性比较低，这可能是乌鳢饲料中抗生素浓度低的一个原因。

由此可见，饲料中的抗生素含量与水产品的养殖模式密切相关，包括投喂方式、病害情况、用药习惯等。

3    结论与讨论

本研究采用超高效液相色谱串联质谱法测定饲料中的四环素类抗生素，当以空白饲料为基质进行加标试验时，4种四环素类抗生素的回收率均很低，无法满足试验要求。本研究最终采用在空白饲料样品中加标的方法制备抗生素的标准曲线用于定量，4种四环素类抗生素的回收率可以达到71.5%～124.9%。

在采集的18个饲料中，共有8种饲料样品中测出1～3 种四环素类抗生素，检出率为44.4%。检测出最高浓度分别为CTC（2 580 ng/g）、TC（546 ng/g）、DOX（425 ng/g）。这应该是养殖过程中管理混乱所导致的交叉污染现象。因此，在养殖过程中，应当加强管理，严禁将饲料与鱼药放在同一个储藏间内。

不同饲料中的抗生素残留差距较为明显，饲料中的抗生素含量与水产品的养殖模式密切相关，包括投喂方式、病害情况、用药习惯等。

4    参考文献

[1] 梁惜梅，施震，黄小平.珠江口典型水产养殖区抗生素的污染特征[J].生态环境学报，2013（2）：126-132.

[2] 李俊锁，邱月明，王超，等.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002.

[3] 周启星，罗义，王美娥.抗生素的环境残留、生态毒性及抗性基因污染[J].生态毒理学报，2007，2（3）：243-251.

[4] ZOU S，XU W，ZHANG R，et al.Occurrence and distribution of antibiot-ics in coastal water of the Bohai Bay，China：impacts of river discharge and aquaculture activities[J].Environmental Pollution，2011，159（10）：2913-2920.

[5] 劉叶新，周志洪，区晖，等.珠江广州河段沉积物中典型抗生素的污染特征[J].华南师范大学学报（自然科学版），2018，50（4）：52-58.

[6] 张美金，林峰，林海丹，等.饲料中四环素类药物含量的高效液相色谱测定[J].分析测试学报，2007（6）：918-920.

[7] 郑卫东，胡丹，郑海峰.数理统计技术在化学分析实验室内部质量控制中的运用[J].食品安全质量检测学报，2013（3）：950-953.

[8] 徐磊，孙博怿，盛鹏程，等.湖州地区典型水产养殖池塘中抗菌药物的污染特征[J].江苏农业科学，2019，47（11）：210-214.