HMS-01在大鼠体内的药动学研究

张 宇，秦 臻，孙 旸，吕加国，吴 芳，刘 霞 （.海军军医大学药学院临床药学教研室，上海 00433；.西安秦申嘉合药物研究有限公司，陕西 西安 70068）

疲劳的定义为机体生理过程不能维持其机能在一特定水平上，或不能维持预定的运动强度[1]。由于疲劳的分子机制并不清楚，目前并无真正官方认可的抗疲劳药物。一些天然产物，如人参、红景天、大蒜等，以及营养补充剂，如维生素、矿物质和肌酸等，报道有抵抗肌肉疲劳、提高运动成绩的效应，但是效果缓慢而不显著[2]；苯丙胺、莫达非尼、咖啡因等药物虽能快速改善疲劳，但实质为中枢兴奋药，存在成瘾、耐受、改变生物节律等问题[3]。因此，抗疲劳药物的进一步研发，对改善生活质量、提升运动成绩、提高军事作业能力有重要意义。

组织糖原含量与疲劳的发生密切相关[4]。本课题组通过大规模化合物合成和筛选，获得了一个全新小分子化合物HMS-01，可以通过促进肝脏和肌肉组织糖原的储存，改善疲劳后组织损伤，显著增加肌肉耐力，发挥抗疲劳的作用。为了进一步了解HMS-01的药动学特点以及在组织中的分布，本课题组采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术[5-6]，研究建立灵敏、特异的测定血浆等生物样品中HMS-01浓度的分析方法，并开展HMS-01在大鼠体内的药动学研究，为后续药物研发提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪（Agilent Technologies，美国）、4000 Q-Trap 型串联质谱仪(AB Sciex，美国)；低温高速离心机（Thermo，德国）；XW 80A型涡旋混合器（医大仪器，上海）；Mettler AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；Millipore-Q超纯去离子水净化仪（Millipore，美国）。

1.2 试药

HMS-01（西安秦申嘉合药物研究有限公司，批号 HMS-1-1010-3）；罗红霉素（Sigma，CAS：2058-46-0）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical）；甲酸（色谱纯，Fisher Chemical）；其他试剂为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Gemini C18(50 mm×2.0 mm, 5 μm)，流动相：含 5 mmol甲酸铵及 1 mmol甲酸的水溶液 (A)-含 1 mmol甲酸的乙腈 (B)，梯度洗脱，洗脱程序如下：0～2 min，90% A；2～6 min，5% A；6～8 min，90% A。流速：0.35 ml/min，柱温：25 ℃，进样量 5μl，运行时间 8 min。

2.2 质谱条件

采用ESI正离子模式，多反应离子监测模式(MRM)进行二级扫描；动态反应监测的离子对参数：HMS-01 772.5→614.5；罗红霉素（IS）837.5→158.1。离子源参数设置：干燥气温度350 ℃；干燥气流速 10 L/min；雾化器压力 40 psi；鞘气温度 400 ℃；鞘气流速 11 L/min；毛细管电压 4 000 V；喷嘴电压500 V。HMS-01 保留时间为 2.834 min，罗红霉素保留时间为2.839 min，色谱图如图1所示。

2.3 标准曲线溶液的配制和质控样品的制备

精密称取 HMS-01 对照品 772.5 mg，置于 10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为77.25 mg/ml对照品储备液。再采用逐级稀释法配置质量浓度为 772.5、386.25、193.125、96.563、 48.281、 24.141、 12.070、 6.035、 3.018、1.509、0.754 ng/ml的系列含对照品血浆溶液；随行质控样品中HMS-01的低、中、高质量浓度分别为 3.09、30.9、618 ng/ml。以上溶液置于 4 ℃ 冰箱备用。

2.4 血浆样品前处理方法

取 50 μl血浆样品于离心管中，加入 200 μl（含41.875 ng/ml的 IS 内标）乙腈溶液，涡旋 60 s，4 ℃条件下 3 000×g离心 10 min，取上清液进样。

2.5 线性关系考察

按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备标准曲线，平行操作5份，按上述LC-MS/MS条件，连续进样分析，以对照品浓度(X)为横坐标，HMS-01的峰面积与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性方程：

线性范围为 0.976～1 000 ng/ml，以信噪比为3或5时测得HMS-01的最低定量限均为976 pg/ml。

2.6 精密度试验

按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度的质控样品，平行操作5份，连续3 d，计算实测浓度。如表1所示，精密度用相对标准偏差(RSD)表示，结果日内精密度RSD≤12%，日间精密度RSD≤9%；准确度以相对回收率表示，实测浓度与理论加入浓度的比值即为相对回收率。结果表明日内、日间结果准确度范围在87%～106%。

2.7 基质效应和提取回收率

按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、高2种浓度含药血浆，平行操作6份；取空白血浆按“2.4”项下处理，甲醇代替内标溶液，取处理好的空白血浆样品加入相应浓度对照品溶液，使之浓度与待测物的峰面积理论浓度一致，分别制备6份；将待测化合物标准溶液用甲醇稀释，使之与待测物的峰面积理论浓度一致，进样6次。基质效应等于（含基质样品的峰面积）/（80%乙腈溶液的峰面积），提取回收率等于（待测物的峰面积）/（含基质样品的峰面积），考察内标的基质效应和提取回收率操作步骤同上。低、高两种浓度待测物及内标提取回收率均在 60%～75%之间，基质效应均在 5.6%～6.1%之间，具体结果见表2。

2.8 稳定性试验

图 1 典型质量色谱图

按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、高2种浓度含药血浆，分别考察样品前处理后室温放置24 h，3 次冻融循环以及-70 ℃ 保存 30 d 的稳定性，测定样品浓度，计算平均值，并计算RSD(%)及相对偏差RE(%)，计算公式：RE%=（实测值-真实值）/真实值×100%。结果见表3。测定结果的RE范围为2%～17%，RSD均小于7%，表明样本稳定性良好。

表 1 HMS-01 在大鼠血浆中的精密度和准确度 (n=5)

表 2 待测物基质效应和提取回收率 (n=6)

表 3 样品稳定性 (n =3)

2.9 HMS-01 药动学研究

SD大鼠12只，分成2组，每组6只，雌雄各半。给药前禁食 12 h，自由饮水。按 30 mg/kg的剂量单次灌胃、1 mg /kg的剂量单次静注给药。灌胃给药的，于给药前和给药后 5、10、20、30 min 和1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h分别眼眶采血约100 μl；静注给药的，于给药前和给药后 3、8、15、30 min和 1、2、3、4、6、8、10、12、24 h分别眼眶采血约 100 μl。血液用 1% 肝素抗凝，8 000×g离心5 min，分离血浆。-70 ℃保存待测。采血过程冰浴避光，以防止光对药物稳定性产生影响。

大鼠单次静注给予1 mg/kg HMS-01后的药动学参数（非房室模型）总结于表4。大鼠静脉注射1 mg/kg HMS-01 后，雄、雌大鼠药动学参数血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）、平均清除率（CL）显示有极显著性差异（P＜0.01），药动学参数血浆消除半衰期（t1/2）、表观分布容积（V）均呈显著性差异（P＜0.05）。雄性大鼠 AUC0-t为 221 ng·h/ml，CL为4.53 L/h·kg，为大鼠肝脏血流量（约 3.3 L/h·kg）的 137%，体内清除快，t1/2约为 0.786 h，V为5.13 L/kg；雌性大鼠 AUC0-t为 409 ng·h/ml，CL为2.41 L/h·kg，为大鼠肝脏血流量的 73%，体内清除较快，t1/2约为 1.27 h，V为 3.82 L/kg。

大鼠单次灌胃给予 30 mg/kg HMS-01后的药动学参数（非房室模型）总结见表5。灌胃给予30 mg/kg HMS-01 后，雄、雌大鼠药动学参数 AUC显示有极显著性差异（P＜0.01），药动学参数CL、F显示有显著性差异（P＜0.05）。在大鼠体内血浆浓度达峰时间tmax为 1.17 h，达峰浓度cmax为1 243 ng/ml，消除半衰期t1/2为 2.00 h。雄、雌大鼠AUC0-t分别为 2 271 和 8 529 ng·h/ml，生物利用度分别为34.3%和69.5%。

表 4 大鼠静注 1 mg/kg HMS-01 后血浆药动学参数 (±s，n=6)

表 4 大鼠静注 1 mg/kg HMS-01 后血浆药动学参数 (±s，n=6)

性别 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml) MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) CLz (L/h·kg) Vz (L/kg) cmax (ng/ml)雄性 221±12.6 221±12.4 0.776±0.022 0.786±0.039 4.53±0.252 5.13±0.388 491±112雌性 409±23.3** 416±21.0** 1.270±0.115 1.090±0.141* 2.41±0.120** 3.82±0.666* 571±55.1合计 315±105 319±108 1.030±0.282 0.940±0.193 3.47±1.17 4.47±0.871 531±90.3

表 5 大鼠灌胃 30 mg/kg HMS-01 后血浆药代动力学参数 (±s，n=6)

表 5 大鼠灌胃 30 mg/kg HMS-01 后血浆药代动力学参数 (±s，n=6)

性别 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml)images/BZ_54_848_2975_848_2977.png MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) tmax (t/h) CLz/F (L/h·kg) Vz/F (L/kg)cmax (ng/ml) F（%）雄性 2 271±666 2 279±667 2.58±0.156 1.43±0.130 1.17±0.289 14.00±4.31 28.5±7.04 729±263 34.3±10.1雌性 8 529±1 920** 9 071±1 529** 4.79±1.39 2.58±1.060 1.17±0.289 3.38±0.629* 13.1±7.78 1757±584 69.5±15.6*合计 5 400±3 661 5 675±3 867 3.68±1.50 2.00±0.924 1.17±0.258 8.69±6.44 20.8±10.7 1 243±694 51.9±22.6

3 讨论

HMS-01在大鼠体内的药动学过程存在显著的性别差异。口服吸收的比较，雌性大鼠的生物利用度远高于雄性，体内的清除速率方面，雌性比雄性慢，与此同时，HMS-01在雌性体内的半衰期也更长。存在性别差异的原因有待进一步深入研究。本实验采用的分析方法的特异性、灵敏性、准确性、精密度及稳定性均满足定量分析的要求。鉴于HMS-01在大鼠血浆中不稳定的情况，在做动物实验时，课题组将采取以下措施：全血采集后立刻在 4 ℃ 下离心 2 min 获取血浆，随即立刻取 50 μl血浆样品加入至200 μl含内标的乙腈中，从而阻断血浆中的水解酶对化合物进行水解。