纳米氧化石墨烯对胶质瘤细胞放射增敏的探讨

江 梦，王麒龙

（1.苏州大学附属第一医院肿瘤科，江苏 苏州 215006；2.苏州大学附属第二医院神经外科，江苏 苏州 215004）

脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，是发病率最高的脑肿瘤，因其呈浸润性生长，与正常脑组织分界不清，手术常难彻底切除。脑胶质瘤具有复发率高、生存期短的特点，单纯手术后平均生存期仅8个月，通过术后辅助放疗和化疗，生存期可提高至11 个月，但中位生存期最长仍不超过2 年。现有的治疗措施难以达到根除该肿瘤的目的，严重影响着患者生存质量和生存期。目前针对脑胶质瘤的治疗原则，还是强调以手术切除肿瘤为主，在此基础上联合放疗和化疗，但疗效并不满意。

石墨烯作为一种新型二维碳纳米材料，以其优良的电学、光学、热学和机械性能，自2004年问世以来倍受研究人员的高度关注。目前有关石墨烯及其衍生物的研究，主要集中在物理学研究领域。近年来，石墨烯的化学和材料学研究也发展迅速，而石墨烯在生物医学领域的研究也逐渐成为热点[1]。之前的研究表明，通过利用纳米氧化石墨烯（nano graphene oxide, nGO）可通过较高的物理吸附作用与芳香环类药物非共价结合的特性[2]，能够递送一些难溶性药物，尤其是抗肿瘤药物，由此可构建一种新型的、具有胶质瘤靶向性的纳米载药系统，并通过体外、体内试验证实其治疗脑胶质瘤具有显著的效果[3-6]。然而我们发现，相对于nGO在化学药物转运领域相对深入的研究，其在放疗效应的研究方面相对缺失。受启发于一系列纳米材料在放射治疗领域的放射增敏效应[7]，本研究采用nGO与国内放疗常用的兆伏级X线联合的方法，来探讨nGO对人脑胶质瘤细胞系U87放射敏感性的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 nGO的制备

1.1.1 天然石墨预氧：石墨中加入浓硫酸、P2O5、K2S2O8，80 ℃持续6 h，之后将所得的产物水洗并过滤，使得其pH值等于7，将产物减压干燥，获得预氧化的石墨。

1.1.2 氧化石墨的制备：将预氧化的石墨，加入适量的浓硫酸，冷却至0 ℃，并在此过程之中缓慢地加入KMnO4，保持温度（20 ℃），持续30 min。然后将温度升至35 ℃，恒温下搅拌2 h（转速250 r/min）。接着加入三蒸水，搅拌15 min（转速：250 r/min）。加入140 mL三蒸水终止反应。往反应液中再次加入双氧水，使得反应液的颜色变成绿色。将反应液置入离心管中高速离心（转速4 000 r/min），并将沉淀用10% HCl反复洗涤并离心3 次，以除去无机金属氧化物。再将所得到的沉淀用三蒸水洗涤至中性，从而得到氧化石墨。

1.1.3 氧化石墨的剥离及纯化：将制备的氧化石墨加入三蒸水，使用超声振荡30 min后常温下12 000 r/min离心15 min，收集上清，即得到氧化石墨烯（graphene oxide, GO）分散液，将收集的GO分散液用三蒸水透析48 h（8 000～14 000 Da透析袋），除去残余无机离子，获得GO分散液。

1.1.4 nGO制备：将已经制备的GO分散液超声振荡1 h，将GO分散液用220 nm孔径的过滤器过滤，收集滤液，常温下透析24 h（8 000～14 000 Da透析袋），得到nGO。

1.2 细胞培养 使用含10%小牛血清的DEME培养液培养人脑胶质瘤U87细胞，培养条件：37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱，细胞贴壁生长良好，每天传代1 次。

1.3 阿拉玛蓝法检测nGO对U87细胞存活的影响 取指数生长期U87细胞，以每孔3 000 个细胞接种于96孔板。以空白组调零，设对照组、药物组（25、50、100、200、400 nmol/L nGO）、单纯放射组（6 Gy-X线）、联合放射组（nGO＋6 Gy-X线），每组设8个副孔，培养24 h后，加入无药培养液继续培养，单纯放射组及联合放射组给予射线6 Gy照射，各组处理后继续培养24 h。每孔加入阿拉玛蓝，酶联免疫检测分析仪测定其吸光度值，以间接反映存活细胞的数量，计算不同浓度及放射条件下的细胞存活情况。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 U87细胞接种于6孔板，培养24 h，设对照组、nGO组（25 nmol/L nGO）、单纯放射组（6 Gy-X线）、联合放射组（25 nmol/L nGO＋6 Gy-X线）。nGO组和联合放射组加入25 nmol/L nGO培养24 h，单纯放射组与联合放射组给予6 Gy X线照射，4组细胞继续培养24 h，依次加入Annexin Ⅴ结合液、Annexin Ⅴ-FITC和PI室温避光染色，染色后立即上流式细胞仪检测。

1.5 统计学处理 实验数据采用SPSS统计软件分析处理。每组实验均重复3 次，独立完成。实验数据以（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nGO的粒径及形态 如图1所示，通过AFM观测GO的粒径，以及GO的厚度。测定结果显示制备的nGO厚度约1 nm。

图1 nGO的粒径及形态

2.2 nGO对U87细胞生长的影响 不同浓度nGO作用48 h后，U87细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），可见低浓度（≤400 nmol/L）nGO对U87细胞无明显毒性。

不同浓度nGO作用24 h，联合放射（6 Gy-X线）24 h后，在400 nmol/L范围内，U87细胞生长抑制率不随nGO浓度增大而逐渐增加。见图2。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 nGO组较对照组G2/M 期细胞比例增加，S期比例下降。见图3。

图3 两个组别的细胞周期比较

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 nGO和X线均能诱导U87细胞凋亡，凋亡率分别为(2.35±1.43)%、(8.14±1.67)%，联合放射组凋亡率为(27.56±1.04)%，显著高于前两组（P＜0.01）。两者联合应用，能明显增加细胞凋亡率。见图4。

图4 nGO和X线诱导细胞凋亡率比较

3 讨论

石墨烯及其衍生物由于具有独特的二维结构、优良的理化特性、制备方法的多样化、成本低廉，适于规模化制备等特点，因而在复合材料、传感器、能源等众多领域具有巨大的应用潜力，成为物理学、化学、材料科学领域研究的热点[1,7]。目前在生物医学领域，较多应用的石墨烯衍生物主要是功能化的GO。由于GO上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，并且利于化学功能化修饰，以达到在不同领域应用的目的。

我们之前的研究结果证明，低浓度的nGO对U87细胞无毒性作用。本研究应用阿拉玛蓝法证实，低浓度（≤400 nmol/L）nGO对U87细胞的生长无明显影响，即低浓度nGO对U87细胞无毒性。nGO联合放射有抑制胶质瘤细胞生长的作用，然而在400 nmol/L的浓度范围内，其抑制作用并未随着浓度的增加而增强。放射组（6 Gy组）可见从第5天开始，加nGO的所有组均比未加nGO组的生长抑制明显，而且第7天其抑制效应最明显，即：其放疗增敏的效应具有时间依赖性而非剂量依赖性。nGO的放疗增敏效应并不随着其浓度的增大而增强；其放疗抑制效应在第7天达到最大。说明低剂量的纳米材料即可达到放疗增敏的作用。

流式细胞仪检测凋亡结果表明，nGO和单纯放射均可诱导细胞凋亡，凋亡率分别为(2.35±1.43)%、(8.14±1.67)%，而联合放射组细胞凋亡率为(27.56±1.04)%，显著高于前两组（P＜0.01），提示nGO能够产生放射增敏。细胞周期研究结果显示，药物组G2/M期细胞比例为(16.31±1.15)%，高于对照组(11.89±3.27)%（P＜0.05），提示nGO作用后胶质瘤细胞周期改变，细胞阻滞于G2/M期，从而增强放射敏感性。

综上所述，本研究结果表明，通过体外实验，nGO联合放射能够增加U87细胞对放射的敏感性，其放射增敏机制可能是通过阻滞细胞于G2/M期、诱导肿瘤细胞凋亡实现的。因此，石墨烯也可能存在放射增敏方面的潜能。然而除此之外，nGO的生物安全性及代谢方面研究相对较少，当nGO进入生物体内，可能对DNA、蛋白质等生物分子产生吸附作用，从而可能引起正常生理功能的改变，这一点也需要引起重视。总之，随着研究的不断深入，nGO有望成为一种极有前景的放射增敏剂。