莲藕PPO基因密码子偏好性特征分析

惠小涵 程婷婷 柯卫东 郭宏波

摘要：为了解莲藕多酚氧化酶（PPO）基因密码子使用偏好性、不同物种中PPO基因同源关系及异源表达受体，本研究运用 CondonW 和 EMBOSS 程序对莲藕PPO基因密码子进行分析。结果表明，莲藕PPO基因偏好性较弱但偏好于G/C结尾的密码子，其中高频密码子有 24 个（同义密码子相对使用度>1），偏好性最强的有 3 个（同义密码子相对使用度>2）。用SPSS和MEGA软件对34种单子叶和双子叶植物的 PPO 密码子进行偏性比较和聚类分析，发现不同物种PPO基因存在不同密码子偏好模式，多数单子叶植物PPO 基因密码子偏好性比双子叶植物强。PPO 密码子相关性分析结果表明，莲藕 PPO 密碼子使用偏好主要受突变压力的影响。在异源转化受体选择中，大肠杆菌真核表达系统适合莲藕PPO的异源表达，拟南芥则是莲藕PPO转基因的理想受体。莲藕PPO密码子偏好模式分析为后续的PPO基因遗传转化研究提供了理论依据。

关键词：莲藕;PPO;密码子;偏好性

中图分类号：S645.1文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0438-09

Abstract：To explore the codon usage preference of polyphenol oxidase（PPO） gene in lotus root， the homology of PPO gene in different species and heterologous expression receptors， the codon of PPO gene was analyzed by CondonW and EMBOSS programs. The results showed that the PPO gene favored codons ending in G or C. There were 24 high-frequency codons （relative synoymous codon usage>1）， and three codons （relative synoymous codon usage>2） had the strongest preference. The PPO codon bias of 34 monocotyledonous and dicotyledonous plants was analyzed by SPSS and MEGA software. It was found that  PPO genes from different species had different codon preference patterns， and most monocotyledonous PPO genes had stronger codon preference than dicotyledons. Correlation analysis of PPO codon indicated that the PPO codon usage preference in lotus root was mainly affected by mutation. In the selection of heterologous transforming receptors， eukaryotic expression system of Escherichia coli is suitable for heterologous expression of PPO in lotus root， and Arabidopsis thaliana is an ideal receptor for PPO transgene. The PPO codon preference pattern analysis of lotus root provides a theoretical basis for the subsequent study of PPO gene transformation.

Key words：lotus root;polyphenol oxidase （PPO）;codon;preference

密码子是在信使RNA上相邻的3个核苷酸残基组成的基本单位，在合成蛋白质过程中，信使RNA上每个三联体核苷酸会编码对应某一个氨基酸，而一种氨基酸会有一种或多种密码子，称为密码子简并性[1]，这是氨基酸合成的规律。其中对应同一种氨基酸的密码子称为同义密码子[2]。在生物长期进化过程中，不同物种的密码子使用频率存在着较大差异，各种生物偏好使用同义密码子，称为密码子偏好性[3]。在转基因研究中，在外源基因[4]的表达和翻译水平等方面会受到不同物种密码子偏好性差异的影响。研究密码子偏好性，便于选择合适的宿主表达系统[5]，以达到提高基因表达水平的目的[6]。莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是莲的地下茎，属木兰亚纲，盛产于湖北等地，有较高的营养价值。莲藕味甘多液可清热凉血，含有黏液蛋白和膳食纤维，可通便止泻、健脾开胃。同时含有铁、钙等多种微量元素，可补气益血、增强人体免疫力，并富含大量单宁酸，可以止血散瘀[7]。然而莲藕不耐储存，极易发生褐变现象，这与多酚氧化酶（PPO）的含量和活性密切相关。多酚氧化酶在自然界中分布极其广泛，在植物[8]、动物[9]和真菌[10]中均可检测到且发挥重要作用，如增强抗性等。多酚氧化酶主要特点是存在分子氧时能催化酚类物质生成有色醌进而形成黑色素。密码子偏好性在芍药[11]、小麦[12]、杉木[13]、橄榄[14]等植物中均有研究，目前莲藕PPO基因密码子使用偏好性还未见相关研究。通过对莲藕PPO基因密码子使用偏好性的分析，讨论其形成的主要因素，再与拟南芥、烟草、酵母和大肠杆菌基因组密码子进行比较分析，为莲藕 PPO 后续的基因研究中选择最佳受体提供依据，也为深入研究莲藕PPO的转基因受体、功能验证、蛋白质结构等提供基础数据。

1材料与方法

1.1数据来源

莲藕PPO基因序列全长2 069 bp（GenBank登录号为FJ999635.1），其开放阅读框为 1 794 bp，编码 597 个氨基酸。凤梨、油棕、小麦、玉米、木薯、川桑、可可等 34 种植物的PPO基因序列来源于 GenBank（ http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），登录号见表1。大肠杆菌（Escherichia coli）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）等生物基因的密码子偏好性数据来源于密码子使用数据库 Codon Usage Database（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。

1.2数据统计分析

采用 CondonW 软件和 CHIPS 在线程序对PPO基因的编码序列（CDS）的有效密码子数（ENc）、同义密码子相对使用度（RSCU）、密码子适应指数（CAI）、第3位碱基G+C含量（GC3s）和总G+C含量（GC）等密码子偏好性参数进行统计。将 34 种植物的PPO 基因的密码子使用偏性用 SPSS 软件进行关联分析，进一步对 PPO 密码子进行中性绘图分析、ENc-plot 分析以及 PR2-plot分析。利用 MEGA 软件并结合组间邻接法（Neigh-bour joining）构建PPO基因 CDS系统发育树。

2结果与分析

2.1莲藕PPO密码子的偏好性分析

2.1.1莲藕PPO的ENc、GC、GC3s和CAI分析由CondonW 程序分析莲藕 PPO基因密码子的GC和有效密码子数[15]。结果显示莲藕PPO基因中密码子的GC和GC3s分别为51.8%和66.3%，说明莲藕PPO基因中的密码子比较偏好以G/C结尾。ENc值为 52.12，大于35[16]，接近61，说明莲藕PPO密码子偏好性较弱，基因表达水平偏低。莲藕 PPO的CAI为0.204，远小于1，进一步证明莲藕PPO对密码子的偏好性弱。

2.1.2莲藕PPO同义密码子相对使用度利用 CondonW、EMBOSS 在线程序分析各基因的 RSCU 值[17]。同义密码子的相对使用度（RSCU）是指在不影响基因编码的氨基酸组成情况下，密码子的实际频率与期望密码子频率的比值，它能够直接反应密码子的使用偏好性[18]。若RSCU大于1则表示密码子的偏好性较强，RSCU小于1则表示密码子偏好性较弱，RSCU值接近于1则表示密码子没有偏好性[19]。计算结果（表2）表明，在莲PPO基因密码子中，RSCU<1的有35个密码子，RSCU=1的有3个密码子，RSCU>1的有24个密码子，其中CAG、UCG、AGG 3个密码子的RSCU值均大于2，说明莲藕PPO密码子中共有24个具有偏好性，其中有3个偏好性极强。

2.2不同物种间PPO密码子偏好性分析

2.2.1不同物种间ENc、RSCU及GC分析不同物种间PPO基因密码子偏好性参数如表3所示，发现单子叶、双子叶植物PPO基因的CAI值相近。且范围为0.165～0.318，远小于1，表明这34个物种PPO密码子使用偏好性都较弱。单子叶植物凤梨、二穗短柄草、小麦等PPO基因的 ENc值为31.00～38.00，平均值为 36.85，双子叶植物莲、苹果、木薯等PPO 基因的ENc值为49.00～56.00，平均值为 53.08，表明这些物种的PPO密码子偏好性及基因表达水平有差异，单子叶植物的PPO基因表达高于双子叶植物，与基于CAI的分析结果相同。34 个物种的GC3s为0.174～0.947，均值为0.682，GC为0.342～0.704，均值为0.569。表明不同物种PPO更偏向于G/C结尾的密码子。其中有10种单子叶植物的GC3s含量均大于 0.8，偏向于G/C结尾的密码子，谷子（Setaria italica）对G/C结尾的密码子的偏性最强。双子叶植物中的GC含量均分布在0.5左右，其中蓟罂粟（Argemone mexican）的 GC3s 为 0.342，偏向于A/U结尾的密码子。34个物种PPO密码子偏好性的RSCU值[20]分析结果表明，RCSU值>1.0的密码子数最多有31个（大叶藻、橡胶树和木薯）;最少的有24个（莲藕）。RSCU值>1.5的密码子数最多有25个（大麦）;最少有6个（可可、金茶花和葡萄）。

2.2.2PPO碱基组成分析用SPSS 软件对PPO密码子成分进行相关性分析[21]，对GC、GC3s、ENc、CAI、密码子偏爱指数（CBI）、最优密码子使用频率（Fop）、第3位碱基U含量（U3s）、第3位碱基A含量（A3s）之间的两两相关性进行分析[22]。表4中ENc 与U3s、A3s这两个参数呈正相关，ENc和GC、GC3s、CAI、CBI、Fop這5个参数呈负相关，说明PPO密码子偏好性越强，其碱基中GC越高。如图 1A 所示，PPO分布在中性分析图回归线的两侧，第1、2位碱基G+C含量（GC12）和GC3s的线性回归系数（斜率）为0.096 8，且在相关性分析中存在极显著相关（P<0.01）。由此推断，密码子的偏好性主要受突变影响。如图1B所示，在ENc-plot分析中，PPO基因密码子分布在标准曲线附近，再次验证其密码子偏好性仅受突变影响。此外，图1C显示，在PR2-plot分析中，基因较多集中在图的中间位置，即密码子C+G和A+U频率基本相同，同时有较少的基因出现在平面图的其他位置，表明多数物种PPO密码子偏好模式主要受突变压力作用。

2.2.3密码子选用偏好性和CDS序列的系统聚类34个物种PPO基因的密码子通过邻接法[23]进行系统聚类分析[24]，如图2所示。在系统发育树中，34个物种大致按照原本的单子叶和双子叶植物进行分类，说明单子叶植物和双子叶植物的PPO密码子偏好模式不同。单子叶植物玉米、高粱、大麦、节节麦归为一小类，且同属禾本科，表明亲缘关系相近的物种表现出相近的PPO密码子使用偏好性。但是同属蔷薇科的苹果和白梨、沙梨没有优先聚类，且遗传距离大于不同属苹果和川桑，同属禾本科的小麦和日本水稻也遗传距离较远，表明不同物种PPO密码子偏好性的差异与物种进化没有必然联系。整体来看，莲藕PPO与其他植物PPO有较高同源性。其中莲藕PPO与葡萄PPO的亲缘关系最近，与猕猴桃PPO的亲缘关系相对于其他植物较近。

2.3莲藕PPO基因受体系统的选择

探究相关基因的功能特征常用的研究植物为拟南芥[25]和烟草[26]，基因原核表达和真核表达系统常用大肠杆菌[27-30]和酵母菌[31]为受体。目前，莲藕的遗传转换没有成熟体系，PPO相关基因的调控网络并不明确，莲藕PPO基因的研究通常需要异源表达[32]，借助如大肠杆菌、酵母菌等遗传转换体系成熟的受体。不同物种存在密码子使用模式差异，在异源表达过程中，应采用密码子使用模式较为相似的受体，提高转录、翻译效率，进而提高表达量。将莲藕PPO密码子分别与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草基因组密码子使用频率进行对比分析。结果表明莲藕PPO基因与大肠杆菌有20组密码子有较大的差别，而与酵母有27组密码子存在较大差别（表5），说明大肠杆菌真核异源表达系统更适用于莲藕PPO异源表达。莲藕PPO基因与拟南芥基因密码子存在较大差别的有19组，与烟草基因密码子存在较大差别的有21组，说明在莲藕PPO基因遗传转化试验中，拟南芥更适合作为异源受体。

3讨论

用生物信息学方法对莲藕PPO密码子偏好模式进行了系统分析研究，ENc为52.12以及CAI为0.204均表明莲藕PPO基因密码子偏好性较弱，基因表达水平偏低。GC3s为66.3%，表明PPO基因密码子较偏好以G/C结尾的密码子。这一结果不符合大部分双子叶植物密码子偏好使用A/U结尾的特征[33]，这可能是在进化过程中受突变的影响，密码子偏好由A、U变为G、C，密码子偏好性产生变化的具体机制和原因还有待深入研究。

中性绘图分析、ENc-plot 分析和PR2-plot 分析结果表明，多数物种PPO密码子偏好模式主要受突变压力影响，其中少数物种PPO受突变作用压力和其他因素的综合作用。34个物种PPO 基因的偏好性分析结果显示，不同物种PPO基因的ENc值和 CAI 值均不相同，PPO 基因在各物种内密码子使用偏好性较弱，单子叶植物PPO基因表达高于双子叶植物，但基因表达量普遍不高。经过长期的自然进化，在突变压力、自然选择和基因功能等各方面综合影响下[34]，密码子的偏好模式会出现差异，整体来说，亲缘关系相近的物种的基因密码子偏好模式比较相似。分析不同物种基因的密码子偏好模式和聚类对物种间系统分类和亲缘关系研究有重要的参考意义。

表达翻译水平与密码子偏好性相关，本研究结果对莲藕PPO基因进行简并引物设计、点突变引入等试验提供了参考价值。目前，莲藕的遗传转换没有成熟体系，PPO相关基因的调控网络并不明确，莲藕PPO 基因的研究通常需要异源表达，借助如大肠杆菌、酵母菌等遗传转换体系成熟的受体。本研究通过比较莲藕与拟南芥、拟南芥、大肠杆菌、酵母菌的PPO基因密码子使用模式的差异，发现大肠杆菌真核异源表达系统更适用于莲藕PPO异源表达试验，在莲藕PPO基因遗传转化功能验证中，拟南芥更适用于异源受体。

通过对莲藕多酚氧化酶密码子的分析发现，该基因密码子偏好性较弱，但较偏好以 G/C 结尾的密码子。这种使用偏好模式主要受突变压力作用，其次受多种因素共同影响。通过比较密码子使用频率发现，大肠杆菌和拟南芥可作为莲藕目标基因异源转化的受体。本试验结果初步揭示了莲藕PPO密码子使用规律，对以后进一步开展转基因功能验证模式作物的筛选有重要的指导作用，同时也可为研究莲藕分子进化提供一定的科学依据。

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（責任编辑：陈海霞）