绞股蓝不同有效成分对ox-LDL诱导的内皮细胞线粒体能量代谢相关蛋白表达的影响*

郑昊龙，宋 囡，曹慧敏，陈 丝，王 杰，吕晓明，贾连群△

（1辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁省中医转化医学研究中心，2北部战区总医院疼痛科，辽宁沈阳110847）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是众多心脑血管疾病共同的病理基础，又是心血管系统疾病中最常见的疾病［1］。绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）是绞股蓝属（Gynostemma）的多年生草本藤本植物，其名最早见于明代的《救荒本草》，具益气健脾，化痰止咳，清热解毒的功效，曾被科技部“星火计划”列为待开发的“珍贵中草药”，在2002年被卫生部列入保健品清单。自20世纪70年代以来，人们已经系统地研究了绞股蓝的化学成分及药理学作用。研究发现其主要药用成分是绞股蓝总皂苷（gypenosides，Gps）。Gps通过降脂，抗血小板聚集和抗血栓形成发挥抗AS作用［2］。Gps是从中药绞股蓝中提取出的有效成分群，由80余种单体皂苷组成，具有人参皂苷的基本结构，均属达玛脂烷醇类结构［3］。绞股蓝因其人参皂苷含量而被誉为“第二人参”。因此，它再次成为近年来研究的热点之一。

线粒体是有氧真核生物中最重要的一种膜性细胞器［4］，一方面，线粒体可以通过生物氧化作用，利用其自身的线粒体DNA编码氧化磷酸化酶复合体的关键亚基，控制高能磷酸化合物三磷酸腺苷（adenine triphosphate，ATP）合成，给予细胞和机体以能量供给，ATP是众多细胞生物过程的必要物质［5］；另一方面，线粒体还可以产生作为细胞氧还原电势和Redox信号原发因子的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）。因此研究认为，线粒体是调节多种细胞生物过程，连接多信号网络通路的综合平台［6］。本课题组前期研究发现线粒体能量代谢在AS的发生发展中发挥了重要的作用，也是中医“从脾论治”AS的重要切入点［7］，但是此过程中相关重要蛋白的变化仍有待进一步探讨。由此，本实验研究以人脐静脉内皮细胞融合细胞EA.hy926为研究对象，观察绞股蓝不同成分Gps、绞股蓝皂苷XLIX（gypenoside XLIX，GpXLIX）和人参皂苷 Rb3（ginsenoside Rb3，GRb3）对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导的内皮细胞线粒体能量代谢相关蛋白的影响，进而探讨绞股蓝不同有效成分防治AS的潜在机制。

材料和方法

1 细胞株

人脐静脉内皮细胞融合细胞EA.hy926购自中国科学院上海细胞库。

2 试剂与仪器

Gps、GpXLIX和GRb3标准品（西安天丰生物科技有限公司）；ox-LDL（广州奕源生物科技有限公司）；DMEM/高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、硫酸青霉素和硫酸链霉素（Thermo Scientific），ATP检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；小鼠抗人细胞色素C（cytochrome c，Cyt C）多克隆抗体、兔抗人细胞色素C氧化酶5a亚基（cytochrome C oxidase subunit 5a，Cox5a）多克隆抗体、兔抗人NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基S1（NADH：ubiquinone oxidoreductase core subunit S1，Ndufs1）多克隆抗体、兔抗人ATP合成酶F1亚基α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5a）多克隆抗体和兔抗人β-actin多克隆抗体（Proteintech）；羊抗兔 HRP-IgG（康为世纪公司）。Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统及配套试剂（ProteinSimple）。

3 方法

3.1 细胞培养 EA.hy926细胞在含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/高糖培养液基中，在37℃、5%CO2条件下进行培养，平均每2 d换1次液，每2～3 d进行1次传代，传代培养至对数生长期备用。

3.2 细胞分组及干预 将培养的EA.hy926细胞分为对照（control）组、模型（model）组、Gps组、GpXLIX组和GRb3组。对照组仅用DMEM完全培养基培养，不加任何药物；模型组予以100 mg/L ox-LDL诱导内皮细胞48 h；Gps组、GpXLIX组和GRb3组均加入100 mg/L ox-LDL作用24 h，然后分别用100 mg/L Gps、GpXLIX和GRb3继续作用24 h。培养结束后进行各项指标的检测。上述药物作用浓度及给药时间参考本课题组前期筛选结果［8］。

3.3 ELISA法检测各组细胞内ATP含量 根据试剂盒说明书完成操作［9］，按照配制标准品，加样，温育，洗涤，加酶，显色，终止等步骤依次完成，最后上机，酶标仪以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（A）值。测定应在加终止液后15 min以内进行。

3.4 Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测线粒体能量相关蛋白的表达 每个样品上样量为4.5 μL，其中包括 5× Master Mix 0.9 μL，样品原液与0.1×样品缓冲液合为3.6 μL，95℃，5 min变性。样品制备后，按照样品、封闭液、I抗、II抗、发光液及清洗缓冲液的顺序分别加入板内，机器自检后分别放入毛细管芯及板子，设计板子布局，开始检测，150 min完成检测，进行结果分析。

3.5 Western blot法检测各组细胞线粒体能量相关蛋白的表达 分别收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，利用蛋白质测定试剂盒检测蛋白含量。以40 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE后，半干转转膜至PVDF膜，按比例配制I抗（Cox5a、Ndufs1、Cyt C、ATP5a及β-actin的抗体），4℃封闭过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔II抗孵育1 h，后TBST洗涤3次。按1∶1比例配制化学发光液，将膜放在曝光板上，膜上滴适量的发光液，应用化学发光成像系统曝光分析图片。

4 统计学处理

采用SPSS 16.0软件处理，数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组细胞ATP含量变化

与对照组比较，模型组细胞ATP含量有所降低（P＜0.01）；与模型组比较，Gps组、GpXLIX 组和GRb3组细胞ATP含量均有不同程度升高（P＜0.01）；其中，Gps对ATP含量的影响明显优于2个单体成分（P＜0.05或P＜0.01），见图1。

Figure 1.ATP content in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Gps group.图1 各组细胞ATP含量的比较

2 各组细胞线粒体能量代谢相关蛋白的表达（Wes全自动蛋白质印迹定量分析）

Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统实时运行稳定，图2显示各蛋白分子量位置较为准确。同时图3显示，与对照组比较，模型组细胞Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达有所降低，Cyt C蛋白表达有所升高（P＜0.01）；与模型组比较，Gps组、GpXLIX组和GRb3组Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达均不同程度升高，Cyt C蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；其中，Gps对Cox5a、Ndufs1和Cyt C蛋白表达的影响明显强于2个单体成分，在2个单体成分中以GRb3的效果为优，而对ATP5a蛋白的影响则是GpXLIX强于另外2个药物。

3 各组细胞线粒体能量代谢相关蛋白的表达（Western blot法）

Western blot法结果与Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统保持一致：与对照组比较，模型组细胞Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达有所降低，Cyt C蛋白表达有所升高（P＜0.01）；与模型组比较，Gps、GpXLIX和GRb3均不同程度地促进Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达，降低Cyt C蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）；其中，Gps对Cox5a、Ndufs1和Cyt C蛋白表达的影响明显强于2个单体成分，在2个单体成分中则是GRb3的效果为优，而GpXLIX对ATP5a蛋白的影响强于另外2个药物，见图4。

Figure 2.Detection quality control of Wes automatic western blot quantitative analysis system.图2 Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统的检测质量控制

Figure 3.Wes automatic Western blot quantitative analysis system was used to detect the protein expression of Cox5a，Ndufs1，Cyt C and ATP5a in each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Gps group.图3 Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测各组细胞Cox5a、Ndufs1、Cyt C和ATP5a蛋白的表达

讨 论

Figure 4.Western blot analysis was used to determine the protein expression of Cox5a，Ndufs1，Cyt C，and ATP5a in each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Gps group.图4 Western blot法检测各组细胞Cox5a、Ndufs1、Cyt C和ATP5a蛋白的表达

动脉粥样硬化的发生和发展是一种多因素参与及相互作用的复杂病理生理过程，其发病机制主要涉及脂质浸润、氧化应激、炎症反应及内皮损伤等多个方面［10-11］。血管内皮功能损伤是AS发生的重要环节［12］。研究表明，细胞通过多种途径和机制，包括蛋白质输入、蛋白质折叠和降解、抗氧化防御、线粒体代谢、线粒体生物合成、线粒体嵴重塑、线粒体的形态改变以及与核协同的转录反应［13］来调节线粒体功能以及稳态。近来的研究表明，AS的相关危险因素如高脂、高糖和炎症等可引发线粒体功能障碍，从而促进AS的发生发展［14］。Gps是绞股蓝全草的有效成分，研究表明，Gps通过降脂、抗血小板聚集和抗血栓等多方面发挥抗AS的作用［15-17］。课题组前期已经明确Gps及其相关有效成分能够降低EA.hy926细胞氧化应激损伤指标，提高细胞抗氧化防御能力和稳定线粒体膜电位，进而对ox-LDL所致内皮细胞氧化应激损伤具有不同程度的保护作用［18］，同时发现绞股蓝总甙及其相关有效成分可以通过影响线粒体呼吸链复合物酶活性及融合裂解蛋白表达防治AS。本文则在前期研究的基础上侧重研究ox-LDL诱导内皮细胞线粒体能量蛋白Cox5a、Ndufs1、Cyt C和ATP5a表达的变化及Gps及其相关有效成分的干预作用，进一步阐明Gps防治AS的潜在机制。

线粒体能量代谢环节主要赖于线粒体呼吸链的上的电子传递，这一过程是线粒体产生ATP的关键环节。线粒体呼吸链上酶复合体的活性和数量决定了其氧化磷酸化的速率，呼吸链上五种酶复合体分别为NADH（复合物Ⅰ）、琥珀酸氧化还原酶（复合物Ⅱ）、细胞色素C氧化还原酶（复合物Ⅲ）、细胞色素C还原酶（复合物Ⅳ）和ATP合成酶（复合物Ⅴ）。呼吸链酶复合物都是由一个或多个亚基所构成的。这些亚基蛋白表达变化可导致相关呼吸链酶活性的改变，进而影响ATP的生成，影响疾病的发生发展。Ndufs1是复合物Ⅰ中最大的亚基（因而被认为是复合物Ⅰ的标志物），有NADH脱氢酶和氧化还原酶活性，能将电子从NADH转移到呼吸链上。Ndufs1作为线粒体复合物Ⅰ中由核基因编码的核心亚基，若其基因发生突变、或者转录和翻译过程中发生异常，均可能导致相关线粒体相关亚基的缺失和表达异常，从而引起线粒体功能紊乱，导致疾病的发生［19］。Cox位于线粒体内膜，处于呼吸链的末端，又是线粒体呼吸链中的关键酶，在整个催化过程中，线粒体基质内质子的耗竭以及其他部位质子的移位不断累积而产生的电化性电位梯度，可以用于ATP的生物合成，因此的活性下降可直接干扰呼吸链的电子传递，进而影响细胞的能量代谢。Cox5a就是线粒体编码的亚基之一，构成了酶的催化中心，具有一定的代表性［20］。Cyt C位于线粒体外膜与内膜之间的空隙内，是线粒体呼吸链中非常重要的电子传递载体，其在复合体Ⅲ至复合体Ⅳ的电子传递过程中发挥重要作用，缺氧条件下，Cyt C由线粒体释放至胞浆中增加，导致传递给复合体Ⅳ的电子减少，而上游电子载体复合体酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ负荷增加，从而导致其功能受损。ATP5a基因编码的是ATP合成酶F1亚基α，ATP合成酶广泛分布于线粒体内膜上，负责将呼吸链中的ADP合成为ATP［21］。可见，以上蛋白均与线粒体电子传输链中发挥重要的作用，进而影响线粒体能量代谢而调控疾病。

本文实验结果首先发现ox-LDL作用内皮细胞后发生了ATP含量的下降，线粒体能量代谢受损，经Gps、GpXLIX及GRb3分别干预后，ATP含量均有不同程度的回升，并且Gps明显优于2种单体成分；进一步探讨其线粒体能量代谢相关蛋白改变，Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统与Western blot法结果保持一致，ox-LDL诱导的内皮细胞Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达有所降低，Cyt C蛋白的表达有所升高，Gps、GpXLIX及GRb3均不同程度地促进Cox5a、Ndufs1和ATP5a蛋白表达，降低Cyt C蛋白的表达；其中，Gps对Cox5a、Ndufs1和Cyt C蛋白表达的影响明显强于2个单体成分，在2个单体成分中以GRb3的效果为优，而GpXLIX对ATP5a蛋白的影响强于另外2个药物。以上实验说明Gps及其相关有效成分可能通过调节线粒体能量代谢相关蛋白表达影响线粒体电子传递链，进而影响ATP的生成，对ox-LDL诱导的内皮细胞具有保护作用，因此可能用于防治AS。本研究为明确中药防治AS的具体成分，并且挖掘相关作用靶点提供了实验依据，但是针对具体的分子靶点，仍需进一步的实验验证。