MRTF-A诱导自噬从而缓解脑缺血再灌注大鼠皮层神经细胞损伤*

李 翔，张 玲，贾 粤，李 桢，赵玉洁，马 兰，李瑞雯，李 力，曹晓璐△

（1武汉科技大学医学院公共卫生学院环境卫生与职业医学教研室，职业危害识别与控制湖北省重点实验室，湖北武汉430081；2武汉科技大学附属普仁医院病理科，科教部，湖北武汉430081）

脑卒中是严重危害人类健康的疾病，2018年我国现患脑卒中病人约1300万，而缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占60%～70%［1］。目前，针对CIS的治疗手段主要是在有效时间窗内实施溶栓治疗，尽快恢复血供以防止缺血区域扩散［2］。一旦超过有效时间窗，可能导致脑细胞不可逆损伤甚至死亡，发生缺血性脑卒中再灌注（cerebral ischemic stroke-reperfusion，CIS/R）损伤，危及生命［3-4］。CIS/R损伤的发生机制如何？是否能有效防止病程发展至CIS/R期？为此本研究探讨了CIS/R损伤的机制，为寻找有效的治疗方法提供科学依据。

SAP蛋白家族的心肌素相关转录因子A（myocardin-related transcription factor-A，MRTF-A）由 807个氨基酸残基组成，是血清反应因子（serum response factor，SRF）的辅助激活因子，在脑组织中表达并参与基因转录调控［5］。研究表明，通过组蛋白乙酰化修饰，MRTF-A可抑制缺血再灌注介导的神经细胞凋亡，但其具体分子机制并未完全阐明［6］。本研究拟在整体动物水平，检测脑缺血再灌注诱导的神经细胞损伤时，MRTF-A对神经细胞凋亡和自噬的影响及相关蛋白的表达调控，初步探讨MRTF-A抑制大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制。

材料和方法

1 动物及处理方法

6周龄SPF级雄性SD大鼠，体重250～300 g，购自三峡大学实验动物中心，许可证号为SCXK（鄂）2018-0045。室温、常规大鼠饲料喂养，动物自由饮水。采用大脑中动脉栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血2 h再灌注24 h建立脑缺血再灌注模型［7］。采用随机数字表法将90只SD大鼠随机分成3组：假手术组（sham组）30只、模型组（MCAO/R组）30只和实验组（Lv+MCAO/R组）30只。假手术组和模型组注射慢病毒空载体，实验组注射MRTF-A高表达慢病毒，注射7 d后假手术组和实验组先各随机抽取5只大鼠用于验证MRTF-A是否成功高表达，其余模型组和实验组大鼠构建脑缺血再灌注模型，假手术组实施手术但不插线栓。

2 主要试剂与器材

MRTF-A高表达慢病毒由上海吉凯基因技术有限公司设计合成；小鼠抗MRTF-A单抗（SC-390324）购自Santa Cruz；小鼠抗β-actin单抗（BM0627）购自BOSTER；兔抗beclin-1单抗（ab207612）购自Abcam；兔抗LC3-I和LC3-II单抗（AF5402）购自AFFINITY；兔抗Bcl-2单抗（bsm-52023R）、小鼠抗Bax单抗（bsm-33283M）和兔抗LC3多抗（bs-8878R）购自BIOSS；山羊抗兔、抗鼠Cy3购自Solarbio；TUNEL试剂盒（MA0223）购自Meilunbio。脑立体定位仪（江苏赛昂斯生物技术有限公司）；激光共聚焦显微镜（奥林巴斯，FV1000）；透射电镜（transmission electron microscope，TEM）由中国科学院武汉病毒研究所分析测试中心提供。

3 主要方法

3.1 MCAO再灌注损伤模型的构建 将直径0.23 mm尼龙线一端反复浸入熔化的石蜡5次，待尼龙线表面石蜡凝固后即制作成栓线备用。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL/kg），仰卧固定于手术台上，取颈部正中切口，剪开筋膜，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）和迷走神经并分离。沿着右侧颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）分叉，分离ECA和ICA，结扎ECA。用动脉夹夹住CCA和ICA，在ECA距动脉分叉5 mm处用眼科剪剪一小口，将栓线缓慢向ICA插入，至ICA与ECA交叉处时，去掉ICA动脉夹，调整插线角度，继续将线栓缓慢向ICA入颅方向推进，插入深度（18.0±0.5）mm为止。将栓线与ECA结扎固定，松开CCA动脉夹，剪除线栓多余末端，最后缝合筋膜、皮肤。缺血2 h之后，抽出线栓，结扎ECA近分叉端，假手术组除不插线外，其余手术步骤同模型组。

3.2 脑室注射慢病毒及免疫荧光验证MRTF-A的高表达 实验组大鼠麻醉后，固定于脑立体定位仪上，在右侧脑室注射2 μL Lv-MRTF-A，滴度为8×1011TU/L（TU：transduction unit），注射位点为囟点后1.72 mm，矢状缝旁开2 mm，深2.6 mm处。慢病毒注射7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，用4%多聚甲醛心脏灌流固定15 min，取出脑组织后继续在4%多聚甲醛中浸泡24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片。用免疫荧光法验证慢病毒注射后是否成功高表达MRTF-A，在此基础上构建脑缺血再灌注模型。

3.3 神经功能评分和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色 缺血再灌注24 h后，对大鼠进行神经行为学变化观察，根据Longa’s 5分法评价大鼠神经功能。活动正常，无神经功能缺损；左前肢不能完全伸展为1分；爬行时向左侧转圈为2分；爬行时向左侧倾倒为3分；不能自发行走，意识丧失为4分。实验中将评分1～4分大鼠纳入研究。术后24 h，将3组大鼠麻醉后取脑，-20℃冷冻30 min，将鼠脑从额极向后连续冠状切面，约2 mm切一层，将脑片置于1%的TTC溶液中，于37℃避光孵育20 min，再置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，扫描仪扫描获取图像，正常脑组织呈鲜红色，梗死脑组织呈白色。ImageJ软件测定各脑片白色梗死区域面积，最后计算梗死体积百分率。

3.4 Western blot检测皮层组织自噬与凋亡相关蛋白的表达 取注射点周围缺血半暗带5 mm范围皮层组织，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制12%的SDS-PAGE分离胶，5%的浓缩胶，50 μg蛋白变性后上样，跑胶，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育I抗（MRTF-A，1∶2 000；β-actin，1∶500；beclin-1，1∶1 000；LC3-I和LC3-II，1∶2 000；Bcl-2，1∶500；Bax，1∶1 000），4℃过夜，TBST洗I抗3次，加入II抗室温孵育2 h，TBST洗II抗后加ECL显影液进行显影，X线胶片曝光、显影、定影，冲洗胶片并扫描成像，使用ImageJ软件进行灰度值分析，以目的蛋白和β-actin的比值进行相对定量。

3.5 TUNEL法分析神经细胞凋亡率联合免疫荧光检测LC3蛋白的表达 石蜡切片60℃烤片1 h，二甲苯脱蜡后梯度乙醇复水，Proteinase K工作液37℃恒温孵育30 min，加入TUNEL反应液，37℃孵育1 h（MCAO/R及Lv+MCAO/R组加入50 μL TdT+450 μL dUTP液；假手术组不加dUTP，仅加入50 μL dUTP液），滴加50 μL FITC液，37℃避光孵育1 h，10%山羊血清封闭30 min，湿盒中孵育I抗（LC3，1∶150）4℃冰箱过夜，孵育II抗（Cy3，1∶200），DAPI核染甘油封片。TUNEL阳性细胞形态多样化且呈绿色荧光，激光共聚焦显微镜下对TUNEL阳性细胞计数并拍照，随机选取大脑皮层S1HL区缺血半暗带5个视野用于分析凋亡率及LC3蛋白表达分布。

3.6 TEM观察神经细胞结构及自噬溶酶体 取大鼠右侧大脑皮层S1HL区缺血半暗带约1 mm×1 mm×1 mm组织，生理盐水清洗，用2.5%戊二醛二甲砷酸钠固定液固定2～3 h，二甲砷酸钠缓冲液洗2次后，在1%四氧化锇中作后固定、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，用TEM观察神经细胞结构及自噬溶酶体，并拍照记录。

4 统计学处理

应用SPSS 22.0统计学软件分析，数据以均数±标准差（mean±SD）表示。两独立样本均数比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用Bonferroni法进行多重比较，不齐时用Dunnett法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高表达MRTF-A后神经功能评分及脑梗死体积的变化

假手术组30只大鼠全部存活；模型组造模成功23只，5只死亡，神经功能评分为0的2只舍去，造模成功率为76.67%；实验组造模成功22只，4只死亡，神经功能评分为0的4只舍去，造模成功率为73.33%。

实验组慢病毒脑室注射后7 d，MRTF-A荧光表达强度显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1A，在此基础上构建实验组MCAO模型。假手术组神经功能评分和脑梗死体积均为0；模型组神经功能评分为2.57±0.20，梗死体积为（31.67±2.73）%；实验组神经功能评分为1.71±0.18，梗死体积为（12.00±1.16）%，与模型组相比均显著降低（P＜0.01），见图1B、C。

Figure 1.The effect of high expression of MRTF-A on cerebral ischemia-reperfusion injury.A：high expression of MRTF-A by lentiviral injection（×400，n=5）；B：neurological function score；C：TTC staining and percentage of cerebral infarction volume.Mean±SD.n=5 in A；n=7 in B and C.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO/R group.图1 高表达MRTF-A对脑缺血再灌注损伤的影响

2 脑缺血再灌注损伤对缺血半暗带神经细胞形态学影响

TEM观察显示，假手术组神经细胞核膜完整，为双层膜结构（图2A1），核周线粒体嵴纹理、内质网、高尔基体形态清晰排列紧凑（图2A2），自噬溶酶体少见（图2A）；模型组神经细胞核膜结构缺损，部分区域呈单层膜结构（图2B1），线粒体、内质网、高尔基体等细胞器明显肿胀变形，大量空泡形成（图2B2），伴随有自噬溶酶体形成（图2B）；与模型组相比，实验组核膜形态恢复为双层膜结构（图2C1），线粒体肿胀程度缓解空泡较少，嵴纹理清晰（图2C2），自噬溶酶体数量进一步增多（图2C）。

3 脑缺血再灌注损伤后MRTF-A诱导自噬和凋亡相关蛋白表达的变化

Figure 2.Observation of nuclear membrane and organelles of the nerve cells under transmission electron microscope.The red arrows indicate the autophagic lysosomes（A，B and C，×1 700），the yellow arrows indicatethenuclear membrane（A1，B1andC1，×5 000），and the black arrows indicate the mitochondria（A2，B2 and C2，×5 000）.图2 TEM观察神经细胞核及周围细胞器的形态结构

Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组LC3-II/LC3-I比值及beclin-1和MRTF-A蛋白表达量的差异无统计学显著性（P＞0.05），Bcl-2/Bax比值显著下降（P＜0.01）；与模型组相比，实验组LC3-II/LC3-I和Bcl-2/Bax比值及beclin-1和MRTF-A蛋白表达量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），见图3。

4 脑缺血再灌注损伤对缺血半暗带神经细胞凋亡及LC3蛋白表达的影响

TUNEL联合免疫荧光法结果显示，假手术组皮层神经细胞核呈圆形饱满，极少有TUNEL阳性细胞，凋亡率为（3.31±2.72）%，LC3蛋白在神经细胞胞浆中表达，分布均匀呈弥散状；模型组缺血侧皮层神经细胞核体积明显缩小，染色加深，胞浆及胞核固缩，细胞核形态多样，含有大量TUNEL阳性细胞，其神经细胞凋亡率为（57.02±11.04）%，与假手术组相比显著升高（P＜0.01），LC3蛋白在神经细胞中呈现聚集状；实验组皮层神经细胞核皱缩较少，细胞核形态多样化，含有少量TUNEL阳性细胞，凋亡率［（42.10±5.20）%］与模型组相比显著降低（P＜0.05），LC3蛋白荧光强度与模型组相比显著升高（P＜0.05），在神经细胞胞浆中聚集更明显，呈斑片状，见图4。

讨 论

MRTF-A在脑、心肌等组织中广泛表达，作为共激活因子与SRF结合形成复合物，作用于靶基因（如即早基因等）的启动子区域CArG box并激活其转录表达，从而调节细胞的生理功能［8］。有研究表明，MRTF-A通过调控ERK/PI3K等信号通路参与细胞增殖、分化及凋亡过程［9-10］。在不同组织器官病理条件下，MRTF-A的作用存在差异。有研究通过敲除MRTF-A或抑制MRTF-A活性，降低巨噬细胞中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，显著减轻缺血再灌注诱导的小鼠急性肾损伤［11］。而我们既往的研究发现，MRTF-A在CIS/R介导的神经损伤早期，具有明显的抑制神经细胞凋亡的作用［6］，但其具体作用分子机制还有待进一步阐明。

CIS/R损伤是CIS临床溶栓治疗后神经功能恢复的主要障碍，其作用机制与自由基损伤、炎症反应和脑血管损伤等多种因素有关，可导致脑内屏障系统结构破坏、微血栓形成并最终导致神经细胞死亡［12-14］。本项目研究也发现，在构建大鼠MCAO模型再灌注24 h后，缺血中心区域脑组织出现大面积坏死，坏死组织周围（缺血半暗带）神经细胞大量凋亡，核周线粒体肿胀变形、嵴模糊不清、空泡化明显，部分核膜变为单层，高尔基体、内质网囊泡肿胀碎裂。因此，逆转缺血半暗带损伤、减少神经细胞凋亡为CIS/R治疗的关键。为了验证MRTF-A可有效抑制CIS/R介导的神经细胞凋亡，本研究在大鼠脑室过表达MRTF-A后构建MCAO再灌注模型，发现缺血侧梗死体积显著减小，缺血半暗带神经细胞凋亡率明显下降，双层核膜和线粒体嵴清晰可见，内质网和高尔基体囊泡完整无碎裂，损伤较轻，说明MRTF-A在CIS/R过程中能有效减少神经细胞损伤和凋亡。据报道，通过维持线粒体的通透性、降低内质网应激作用可明显减轻CIS/R过程脑组织损伤［15-16］。MRTF-A对CIS/R过程中对神经细胞的保护作用可能也与维持神经细胞内线粒体、内质网等细胞器正常的结构和功能有关。

为了进一步研究MRTF-A的抗神经损伤的相关分子机制，我们检测了凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达水平。Bcl-2与Bax共属于一个家族，通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡激活物，Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强［17］。我们前期的研究证明，在培养的原代神经细胞中，MRTF-A可通过结合至bcl-2基因启动子CArG box区域，上调Bcl-2的转录活性［18］。在本研究中，CIS/R过程导致神经细胞抵抗凋亡能力显著降低，Bcl-2/Bax比值显著下降；而高表达MRTF-A的大鼠在CIS/R发生24 h后，Bcl-2/Bax比值显著升高了，提示MRTF-A通过激活Bcl-2并抑制Bax通路显著增强缺血条件下机体对CIS/R介导的凋亡抗性。这也进一步在整体动物水平证明了MRTF-A对抗凋亡基因bcl-2表达的调控作用。

Figure 3.The protein expression of MRTF-A，autophagy-related molecules and apoptosis-related molecules.A：the expression levels of MRTF-A，beclin-1，LC3-I and LC3-II；B：the expression levels of Bcl-2 and Bax.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO/R group.图3 MRTF-A、自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达情况

自噬是一种高度保守的细胞行为，通过溶酶体降解途径进行自我吞噬，一般经历形成吞噬泡、自噬小体和自噬溶酶体3个过程［19］。目前主要认为，自噬是一种细胞自我保护机制，可以有效抵御外界恶劣环境刺激，延缓细胞凋亡，但多度或过快的自噬也会导致自噬性细胞死亡［20］。本研究发现，在生理情况下神经细胞自噬水平较低，MCAO再灌注模型组中，缺血半暗带区神经细胞自噬溶酶体数量增加，而高表达MRTF-A后的MCAO再灌注后，实验组神经细胞自噬溶酶体进一步增多，提示MRTF-A增强了CIS/R过程中神经细胞的自噬水平。一项老年大鼠MCAO模型实验表明，通过慢病毒过表达NMNAT1，激活PI3K/Akt信号通路，可增强神经细胞自噬水平，缺血侧脑梗死体积明显减小［21］。这与我们的研究结果相似，说明增强自噬水平，的确可以减轻CIS/R介导的脑损伤。

自噬发生能促进LC3蛋白脂质化：非激活型胞质LC3（LC3-I）经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合的LC3-II［22］。本研究发现，MRTF-A高表达MCAO再灌注模型LC3-II/LC3-I的比值显著升高，说明此时神经细胞中大量LC3-I向LC3-II转变，自噬小体形成增加。形态学观察发现，正常情况下神经细胞LC3在胞浆中均匀分布表达，而造模后LC3发生聚集性改变，且MRTF-A高表达MCAO再灌注模型的LC3蛋白聚集性进一步增加，呈斑片状改变，这也说明了MRTF-A的确在增强凋亡抵抗力的同时调控了自噬相关基因LC3的表达，从而促进了神经细胞自噬水平。

Figure 4.The effects of high expression of MRTF-A on the nerve cell apoptosis，and LC3 expression and distribution.A：images of TUNEL and immunofluorescence（×400；A1，A2，A3：×1 600）；B：apoptotic rates of the nerve cells；C：fluorescence intensity of LC3 protein.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group.图4 高表达MRTF-A对神经细胞凋亡及LC3表达分布的影响

已有研究表明，上调beclin-1在哺乳动物细胞中的表达，能够刺激自噬发生［23］。我们研究发现，MCAO再灌注模型beclin-1表达水平略有升高，高表达MRTF-A后发生CIS/R过程中，beclin-1表达水平显著升高。这一结果进一步证明了MRTF-A可以通过上调自噬相关基因、激活自噬通路来增强自噬作用。有研究报道，Bcl-2作为抗凋亡蛋白，能与beclin-1的BH3结构域结合，两者相互作用并调节自噬水平［24-26］。在我们的研究中，当大鼠大脑过表达MRTFA后，缺血区Bcl-2上调的同时beclin-1表达水平持续升高。其原因一方面可能由于MRTF-A调控了其他beclin-1依赖的自噬通路发挥了作用；另一方面可能是由于在神经细胞凋亡程度较重前提下，自噬被MRTF-A激活并有效的抑制了神经凋亡，但其详细调控机制还有待进一步验证探讨。

综上所述，CIS/R诱导了大鼠皮层神经细胞的凋亡和轻微自噬反应，MRTF-A通过上调LC3-II和beclin-1表达，增强自噬作用，并通过激活Bcl-2、抑制Bax来增强机体的抗凋亡能力。但自噬的发生十分复杂，MRTF-A在诱导自噬过程中处于何种地位仍需进一步阐明。