蚕种检测实验室间比对试验的实施

徐 杰 谢余涛 张三妹 楼 霞 朱春群 陈 涛 张美蓉 侯启瑞

(1浙江省蚕种质量检疫检验站，浙江杭州 310020； 2农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心(镇江)，江苏镇江 212018)

为验证实验室的检验能力，确保检验工作的公正性、科学性、准确性和权威性，加强实验室间的信息交流与成果共享，提高蚕种质量的检验水平，农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心(镇江)于2018年底组织开展了全国蚕种质量实验室检测能力比对试验，全国蚕桑主产省的13家省部级蚕种质量检验检测实验室参加了比对试验。检测结果的有效性是检测实验室关注的重点，选用与实验室工作类型和工作量相适应的方法，有计划地实施质量控制是保障检测结果有效性的重要手段；质量控制是质量管理的一部分，实验室通过有计划和有系统的活动，向内部(管理层)和外部(客户、认证认可机构)提供信任，表明实验室能够满足质量要求；“参加能力验证或机构之间比对、机构内部比对”是标准规定的实验室应实施的质量控制方法[1]。

实验室间比对是在预定的条件，由2个或2个以上实验室就同一或相似的检测对象进行检测或测量的组织、实施和评价[2]。通过实验室间比对可以确定实验室的能力、识别实验室存在的问题与实验室间的差异，是判断和控制实验室能力的有效手段之一。本文结合工作实际，阐述了蚕种质量检测实验室间比对试验的组织实施和结果分析评价方法，以期提高参加比对实验室的蚕种质量检测能力，达到行业质量控制的目的。

1 实验室间比对试验的组织实施

组织实验室间比对试验，应制定比对试验计划，参加比对试验的实验室应严格按计划实施。比对试验计划至少包括以下内容。

1.1 参加实验室

选择参加比对的实验室需考虑2点：一是比对实验室的设施设备和人员能力应大致相当，有可比性；二是根据结果统计方法确定参加实验室的数量。

1.2 比对项目

蚕种检测有母蛾微粒子病检疫和成品卵质量检验2大类，项目包括良卵粒数、良卵率、孵化率、杂交率(纯度)、病卵率、病蛾率等。

1.3 样品制备

成品卵样品采用标准方法[3]制备。母蛾样品采用自制方法制备，确保检测结果的一致性。

1.4 均匀性和稳定性检验

采用成品卵样品时，一般应进行均匀性检测。另外，如果运输和时间对检测的特性量(良卵粒数、良卵率、孵化率等)可能产生影响时，还需要进行稳定性检验。

1.4.1 均匀性检验 从样品总体中随机抽取10个样品，按单因子方差分析(F检验)方法对特性量进行均匀性检验[4]，每个样品重复测定2次，使用Microsoft Office Excel 2007进行数据统计。当统计量F值<临界值Fcrit时，认为样品是均匀的。当检测样品有多个待测特性量时，可从中选择有代表性和对不均匀性敏感的特性量进行均匀性检验。一般可选择良卵率项目，如果时间允许，应选择孵化率项目。均匀性检验结果分析案例如下：打开Microsoft Office Excel 2007，按表1格式输入数据。第1步在“工具

表1 家蚕成品卵2次良卵率检验结果%

栏”上点击“数据”按钮；第2步，点击右侧“数据分析”按钮，选择“方差分析：单因素方差分析”，点击“确定”；第3步，在“输入区域”选择表1中第2、3列数字区域，“分组方式”选择“行”(分组方式取决于表1数据的排列方式，如横排，则选择“列”)，“输出区域”选择表1区域以外空白单元格。完成上述设置后，点击“确定”，可在选定区域内输出分析结果。结果包括2张表，其中一张是各组情况概述表(表2)，内容包括各组的总和、平均数、方差和样本含量，另一张为方差分析表(表3)。

表2 家蚕成品卵良卵率均匀性检验情况%

表3 家蚕成品卵良卵率均匀性检验方差分析

差异来源离均差平方和(SS)自由度(df)均方(MS)统计量F值概率值P-value临界值F crit组间0.05890.0060.4390.8843.020组内0.148100.015总计0.20619

表中统计量F值(0.439)<临界值Fcrit(3.020)，表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。如果均匀性检验显示样品是不均匀的，则需要重新选择比对样品。

1.4.2 稳定性检验 从样品总体中随机抽取20个样品，分成2组，分别置于11 ℃(中间感温温度)和25 ℃(运输途中可能接触的最高气温)环境下放置5 d(运输最长送达时间)后，按t检验法对特性量进行稳定性检验[4]，检测方法、人员、仪器与均匀性检验相同。使用Microsoft Office Excel 2007进行数据统计。当tStat值

表4 不同温度下家蚕成品卵良卵率%

表5 不同温度下家蚕成品卵良卵率稳定性t-检验分析

t-检验项目11 ℃良卵率25 ℃良卵率平均99.6199.61方差0.0020.002观测值1010合并方差0.002假设平均差0自由度(df)18t Stat值6.77E-13P(T≤t) 双尾1t 双尾临界值2.101

11 ℃为中间感温温度，25 ℃为运输途中可能接触的最高温度。表5中tStat值(6.77E-13)

1.5 样品的保存和发放

样品保存和发放的环境、时限应根据比对项目做出相应的规定。

1.6 检测方法和数据处理

可选择标准方法、非标准方法或自制方法，无论何种方法，都应该制定详细的作业指导书，确保检测在相同的环境条件、规定的操作流程、相当的仪器设备下进行。

比对计划应明确规定各参加实验室在上报每个检测数据及计算平均值时的有效位数和修约标准，确保所采集的数据正确和合理，保证统计结果可靠。

由于现行蚕种检验标准中对检测结果没有要求提供测量不确定度，比对组织者可根据需要确定参加者是否提供结果的测量不确定度。

1.7 统计处理和评价

检测数据的统计方法应根据数据的特性(定量或定性)、被测量所要求的准确度、最少参加实验室数量、样品数量、检测重复次数等因素来选择。统计方法包括差值D(实验室偏倚的估计值)、百分相对差D(%)、Z比分数、En值等。根据不同统计方法制定相应的评价准则。

2 结果分析评价

2.1 定性方法

定性方法是为评价实验室表征特定实物的能力而设计的(例如识别微粒子孢子)。定性方法可能包含比对计划组织者专门制备外加目标组分的检测物品(例如在母蛾样品中添加微粒子孢子)。因此，在性质上这种计划是“定性”的，它只需要依据是否检测到“目标组分(微粒子孢子)”来评价实验室的能力。对于定性结果，通常无需计算。

2.2 定量方法

2.2.1t检验法 参加实验室数量是2个时，可采用t检验法进行结果评价(参照1.4.2稳定性检验)，当tStat值

Z比分数法可采用传统统计方法或四分位数稳健统计方法进行结果分析评价，方法选择应考虑比对需求和参加实验室数量等因素。四分位数稳健统计方法在异常值检出的灵敏度上高于传统统计方法[5]，参加实验室的数量需大于9个。

(1)传统统计法。应用传统统计法，通常需要剔除离群值(异常值)，可采用莱茵达准则、格拉布斯(Grubbs)准则等统计方法判断离群值[6]，在剔除离群值后计算平均值和标准差。以蚕种检测为例，在传统统计方法中，指定值X可以是结果平均值，能力评定标准差σ可以是经验值，σ值假设如表6所示。以克卵粒数项目检测为例，3个实验的3个平行样检测比对分析评价结果见表7，3个实验室的克卵粒数项目检测Z值均小于2，表示比对结果满意。

表6 家蚕种成品卵各检测项目σ值设定

检测项目克卵粒数/粒良卵率/%孵化率/%杂交率/%标准差σ100.250.500.50

各实验室克卵粒数与克卵粒数平均值的差值应在20粒以内，各实验室良卵率与良卵率平均值的差值应在0.50%以内，各实验室孵化率与孵化率平均值的差值应在1.00%以内，各实验室杂交率与杂交率平均值的差值应在1.00%以内，比对结果才能达到满意。

表7 家蚕种成品卵克卵粒数传统统计法比对结果

实验室编号克卵粒数/粒ABC参加者成绩xZ值结果评价11 5001 5051 5101 505-0.20满意21 4851 4901 4951 490-1.70满意31 5201 5251 5301 5251.80满意

x的平均值X为1 507粒，标准差σ为10粒。

表8 家蚕种成品卵克卵粒数四分位数稳健统计法比对结果

实验室编号克卵粒数A/粒克卵粒数B/粒标准化和(S)标准化差(D)实验室间Z比分数(ZB)实验室内Z比分数(ZW)结果评价11 6741 6752 368.46 -0.71 0.22 0.00 满意21 6691 6712 362.09 -1.41 -0.28 -0.22 满意31 6851 6842 382.60 0.71 1.35 0.45 满意41 6831 6792 377.65 2.83 0.96 1.12 满意…131 6721 6752 367.04 -2.12 0.11 -0.45 满意中位值1 6731 6712 365.63 -0.71 标准化四分位距8.90 8.52 12.58 3.15 稳健变异系数/%0.53 0.51 最大值1 6851 690最小值1 6661 666极差1924

为直观地显示每个实验室的比对结果，可根据表8制作Z比分数序列图。图1按照大小的顺序给出每个实验室的Z比分数(ZB)，并标有实验室的代码(因保密要求，不直接提供实验室名称)，使每个实验室能够很容易地与其它实验室的结果进行比较。

图1 克卵粒数实验室间ZB值分布图

图1的绘制方法如下：第1步，打开Microsoft Office Excel 2007，将实验室代码和ZB值按竖排方式输入。选中全部输入内容，点击工具栏右侧“排序和筛选”按钮，点击“自定义排序”，在“关键字”中选择“ZB”，“次序”中选择“降序”，点击“确定”；第2步，选中排序后“ZB”列，点击工具栏“插入”按钮，点击“柱形图”，选择“二维柱形图”第一类，在右侧空白区域弹出草图。点击“选择数据”按钮，弹出“选择数据源”对话框，点击“编辑”按钮，选中实验室代码列数字部分，点击“确定”，再点击“确定”；第3步，点击工具栏“布局”按钮，选择“数据标签”中的“其他数据标签选项”，在“类别名称”前打钩，去掉“值”前钩号，点击“关闭”；第4步，点击图中的横坐标，按键盘“删除”键，删除图中重复的实验室代码，一张柱状图就初步完成了。可以根据需要，通过选择“布局”按钮下方的“图表标题”“坐标轴标题”“坐标轴”来美化柱状图。

3 技术分析和建议

在完成结果统计评价后，比对试验组织者应结合比对过程中发现的问题进行分析，就检测方法的选择、检测过程的质量控制、对作业指导书的理解等方面提出相应的改进建议。

一次成功的实验室间比对试验，有利于各实验室发现问题，找到差距，规范操作，提高检测能力，提升客户的信任度。开展全国蚕种质量检测实验室间的比对试验，检验并验证了各实验室的检测能力，加强了各实验室间的交流、经验共享与共同提高，进一步改进并完善了相关检测技术和方法。