某地区四种高危型HPV病毒基因启动子上游长控制区与E2区基因突变的分析

（江西省萍乡市妇幼保健院生殖遗传研究室，江西 萍乡 337000）

子宫颈癌是世界上恶性肿瘤中的第二大杀手，而高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续性感染是宫颈癌发生的根本原因。HPV是一种小型双链DNA病毒，病毒基因组含有近8000 bp碱基，由早期区（E）、晚期区（L）和长控制区（LCR）三部分组成，其中E区编码E1-E7七种蛋白质。病毒在浸染细胞后，首先E 区DNA序列整合进入细胞DNA，在断裂位点的整合导致HPV基因组中p97启动子的失活[1]。正常情况下，启动子p97能抑制HPV病毒表达E6和E7蛋白，这两个蛋白不仅可以与细胞抑癌蛋白P53和PRb蛋白结合，干扰调节细胞生长和细胞凋亡的正常途径，同时使HPV感染的上皮细胞具有更强的增殖优势[2-4]。研究发现，不同地区HPV病毒各个亚型都存在不同程度的变异，并且突变基因位点各有不同，所导致的HPV致病性也存在不同程度的差异。本研究旨在通过分析萍乡地区四种高危型HPV感染者所携带病毒E2区和LCR区序列突变，以期发现该地区四种HPV的E2区和LCR区的变异情况，以及不同病变程度突变是否存在着差异。

1 资料与方法

选取2013年6月至2018年4月入萍乡市妇幼保健院住院妇科病理明确诊断宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的患者进行追踪。纳入标准：①经病理明确诊断；②并有HPV16、18、52、58四种高危型中的一种病毒感染的患者；③拟定HPV16、18、52、58四种高危型的病例数分别为50例、26例、50例、50例。采集HPV16、18、52、58四种高危型病毒感染患者的宫颈脱落细胞，提取核酸后送广州凯普生物科技有限公司进行测序，分析E2区及LCR区序列变化。

2 结果

将测序所得数据与NCBI数据库进行比对分析，结果发现：①宫颈上皮内瘤变患者与宫颈癌患者所携带的HPV16型在E2区分别有128个和73个突变点，在非编码区LCR区均未发现突变点。②宫颈上皮内瘤变患者与宫颈癌患者所携带的HPV18型在在E2区分别有0和12个突变点，在非编码区LCR区的突变点分别为6个和163个。③宫颈上皮内瘤变与宫颈癌患者所携带的HPV52型在E2区分别有116个和40个突变点，在非编码区LCR区分别为68和10的突变点。④宫颈上皮内瘤变与宫颈癌患者所携带的HPV58型在E2区的突变点分别为298个和0个，在LCR非编码区分别有51和0个突变点。所有的突变位点统计见表1。

统计宫颈上皮内瘤变和宫颈癌患者中四种型别HPV在E2区和LCR区出现3次以上的突变位点，见表2。结果显示，在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌患者中HPV16型感染中E2区3266delA和274insT发生频率较高，没有显著性差异；HPV52型LCR区中7882delA突变位点在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌患者中存在显著性差异；HPV58型E2区和LCR区中3284delA、3262delA和7734delC突变位点在宫颈上皮内瘤变患者中发生率较高，而在宫颈癌患者中未见突变。

表1 宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中四种型别HPV的E2区和LCR区域突变数

表2 宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中HPV的E2区和LCR区域突变分布情况[n（%）]

从表1、表2数据可初步得出以下结果：①HPV16和HPV52型人乳头瘤病毒E2区的基因突变数目在宫颈上皮内瘤变中要明显多于宫颈癌，这表明宫颈上皮内瘤变与E2区的改变有较强的相关性。②HPV18型在萍乡地区感染病例数较少，且该型别突变位点主要在LCR区，呈散在分布，提示萍乡地区的HPV18型所致宫颈癌病变可能与LCR改变相关；③HPV58型的突变点主要分布在E2区并以3284delA、3262delA、7734delC为主，提示HPV58型E2区与宫颈内瘤变相关；④HPV16型和HPV58型LCR区的保守性要远高于E2区。

3 讨 论

HPV病毒能够依据具有高度保守性的L1基因进行分型，为临床诊疗提供方向[5]。相比较L1基因的研究，HPV内部其他区域的研究就相对匮乏，例如对病毒的整合及致癌性有重要作用的LCR序列和E2基因区。LCR是非编码区，但却是HPV中最重要也是最复杂的区域，它调控着E区和L区的表达。LCR由早期的启动子、增强子和沉默子结构组成。如HPVl6型病毒E6/E7的表达直接受到HPV早期启动子p97的控制，该启动子又受到其他调节结构的调控[6-7]。

E2所表达的蛋白是HPV病毒E6/E7的转录阻遏物[8]，在HPV病毒基因组整合进人的基因组时会导致E2的编码区受到破坏，从而解除了对E6/E7的转录抑制[9]。因此，E2的序列改变被认为在宫颈内瘤变发展成宫颈癌的过程中发挥着重要的作用。

本课题通过对总样本176例宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的患者的四种高危型HPV的E2基因和LCR序列进行分析，发现感染16、52、58型HPV的宫颈上皮内瘤变患者体内HPV病毒LCR区及E2区突变比例较在宫颈癌患者中的显著性增加，而18型HPV LCR区和E2区突变比例在宫颈癌患者更高，且保守型高，提示不同高危型别HPV导致宫颈癌变进展的方式或不相同，HPV18型可能是因为LCR区的突变导致了E6/E7蛋白表达，从而加速了癌变的进展；16、52、58型HPV在宫颈上皮内瘤变患者中突变比例较高，而在宫颈癌患者中较低，且存在较高突变频率的突变位点，非散发型，这提示HPV16、52、58型多态性较高，某些高频的突变位点可能是导致癌变进展的重要因素，这些高频突变位点还有待进一步通过实验进行验证。萍乡地区不同高危型HPV的E2基因和LCR序列差异分析将有助于我们更好地研究本地区的HPV病毒及其防治，为临床治疗和预防提供帮助。